本文關(guān)鍵詞： 有機自由基 TEMPO 葉酸受體 磁共振成像 Hela細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)技術(shù)是目前作為最方便的非侵入性成像技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床診斷。相對其他成像技術(shù),MRI有絕對的優(yōu)勢,例如,固有的高空間分辨率、無放射性輻射、快速采集體內(nèi)圖像和長效成像等。MRI能提供高質(zhì)量軟組織3D圖像和解剖高分辨率的圖像用于觀察藥物的轉(zhuǎn)運,檢測體內(nèi)生物學(xué)過程和功能上的改變。在過去的幾十年,MRI研究中最活躍的鄰域是研制具有高弛豫性,良好生物相容性和選擇性靶向器官或組織的MRI對比劑。MRI造影劑是用來增強正常組織之間、正常與病變組織之間的磁共振信號對比度的一類化學(xué)試劑。通過采用造影劑可以幫助提高成像的靈敏度和對比度。例如,能導(dǎo)致T2加權(quán)MR圖像暗對比的超順磁性氧化鐵(SPIO)納米微粒,在臨床應(yīng)用方面,作為陰性對比劑,從造影劑非靶向聚集于特定組織觀察疾病發(fā)展到細(xì)胞生物分子標(biāo)記物的靶向監(jiān)測都有研究。另外,順磁性金屬離子復(fù)合物,如Gd3+和Mn2+能使周圍水質(zhì)子產(chǎn)生顯著自旋晶格弛豫,引起T1加權(quán)MR圖像形成明亮的陽性對比增強效應(yīng)。目前MRI檢查超過30%應(yīng)用的是順磁性Gd3+復(fù)合物。但是金屬離子造影劑也存在嚴(yán)重的問題,例如釓造影劑應(yīng)用于腎功能不全患者也增加了腎源性系統(tǒng)性纖維化(Nephrogenic Systemic Fibrosis,NSF)的發(fā)生機率�；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)自1993年首次報道使用了釓雙胺的患者發(fā)現(xiàn)NSF以來,NSF的增加和我們逐漸增加使用釓雙胺來實現(xiàn)MRI增強呈平行增長,引起了關(guān)注。目前認(rèn)為出現(xiàn)NSF可能是釓雙胺中釋放出來的游離Gd的毒性反應(yīng),游離Gd有劇毒,特別是它的離子形態(tài)(Gd3+),而在腎病患者中Gd對比劑會有更長的半衰期,限制了這類造影劑用于嚴(yán)重腎功能不全患者。為了避免這些問題的出現(xiàn),研究者一方面針對現(xiàn)有順磁性金屬類造影劑,通過提高對比劑螯合物的穩(wěn)定性,得到高弛豫率和有效性的小劑量低暴露的自由釓離子,提高對比劑的效用和安全性；另一方面,致力研發(fā)合成生物相容性好、安全性能高、成像效果好、在體內(nèi)有適當(dāng)?shù)臏魰r間且易于排泄的新型T1造影劑,如順磁性的有機穩(wěn)態(tài)自由基類復(fù)合物。有機自由基是指由氮氧化合物形成的自由基,因擁有孤立不成對電子而具有順磁性這一特性,可以用于臨床磁共振成像對比增強。以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(2,2,6,6-Tetramethylpiperidinooxy,TEMPO)為代表的六哌啶類穩(wěn)態(tài)有機自由基,因其自旋孤立電子產(chǎn)生的超磁性,具有高T1弛豫性能。所以非金屬的有機自由基對比劑能提供一個除了釓類陽性對比劑外的另一種選擇。 本研究即是以聚乙炔(Polyacefylene,PA)作為良好的載體,2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(2,2,6,6-Tetramethylpiperidinooxy,TEMPO)作為磁性物質(zhì),通過引入PEG鏈提高親水和長循環(huán)特性,制備一種新型的具有良好水溶性、長循環(huán)及高T1弛豫性能的有機自由基MRI造影劑(PA-TEMPO)。并通過靶向基團葉酸(Folic Acid,FA)及熒光素(Fluorescein,FI)鏈接到PA上對有機自由基造影劑進行修飾,制備葉酸修飾、熒光素FI標(biāo)記的新型靶向磁共振造影劑(PA-TEMPO-FI-FA),用于葉酸受體高表達(dá)腫瘤的早期診斷。 目的 制備葉酸修飾、熒光素標(biāo)記的含非金屬穩(wěn)態(tài)有機自由基的靶向特異性造影劑(PA-TEMPO-FI-FA),利用Hela陽性腫瘤細(xì)胞的裸鼠模型,探討該大分子造影劑對腫瘤靶向成像的可行性及體內(nèi)成像特點。 第一章磁共振造影劑應(yīng)用及研究進展 第二章新型有機自由基磁共振造影劑的制備與體外表征 2.1材料與方法 2.1.1含TEMPO聚丙炔胺衍生物磁共振造影劑PA-TEMPO的制備 采用丙炔胺、丁二酸酐、4-羥基TEMPO和PEG2K聚合反應(yīng)生成含TEMPO聚丙炔胺衍生物(PA-TEMPO)。 2.1.2單獨熒光標(biāo)記的磁共振造影劑PA-TEMPO-FI、葉酸修飾和熒光素標(biāo)記的靶向磁共振造影劑PA-TEMPO-FI-FA的制備 PA-TEMPO與FI反應(yīng),合成了具有熒光標(biāo)記的PA-TEMPO-FI;PA-TEMPO與FA和FI反應(yīng),合成含PA-TEMPO的靶向特性造影劑]'A-TEMPO-FI-FA大分子物質(zhì)。 2.1.3新型有機自由基磁共振造影劑理化特性的初步研究： 采用紅外光譜儀和核磁共振譜儀對含TEMPO乙炔衍生物1,含PEG2K乙炔衍生物2和有機自由基磁共振造影劑(PA-TEMPO)進行檢測。 2.2結(jié)果 丙炔胺衍生物1和丙炔胺衍生物2單體用波譜分析,得到的數(shù)據(jù)與其分子結(jié)構(gòu)相符。分析PA-TEMPO的波譜,證明丙炔胺衍生物1和丙炔胺衍生物2單體聚合反應(yīng)后成功得到聚丙炔胺衍生物PA-TEMPO. 第三章新型有機自由基磁共振造影劑的評價 第一節(jié)新型有機自由基磁共振造影劑體外性能評價 3.1材料與方法 3.1.1體夕(?)PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA細(xì)胞毒性 采用MTT法檢鋇(?)Hela細(xì)胞的相對存活率：Hel細(xì)胞用完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)在37℃,50%C02和95%大氣壓環(huán)境下,將Hela細(xì)胞接種于96孔板中(6×103個/孔),繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后,分別加入含不同濃度的PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后,加入10uL濃度為5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,繼續(xù)孵化4h,加入150ml DMSO,平板震蕩儀震蕩10min,在酶標(biāo)儀(BioTech ELX800instamaents)中測定490nm波長處的吸光度值(OD值),不含樣品溶液培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-對照組OD值)／對照組OD值×100%。統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS20.0軟件包,利用完全隨機分組兩因素析因設(shè)計法分析資料,并對結(jié)果進行方差分析,考察兩個處理因素對細(xì)胞毒性影響的差異是否有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05則認(rèn)為有顯著性差異。 3.1.2檢測(?)PA-TEMPO.PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA體外磁共振T1信號及弛豫效能 PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA用PBS稀釋,濃度為1、3、5、10mM并與PBS分裝于5只試管中,置于塑料試管架上,在3.0TMR機器上進行T1掃描,采用8通道頭部線圈,掃描序列采用SE T1WI及T1mapping,隨后測量各個濃度試管中部T1信號值及T1弛豫時間,取其平均值,計算樣品的T1信號值及T1弛豫率,弛豫率r1即是PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液濃度與1/T1直線方程的斜率。 3.1.3體外細(xì)胞攝取熒光成像 將Hela細(xì)胞懸液接種于24孔板中(1×104個/孔)的爬片上過夜后加入含PA-TEMPO-FI(對照組)或PA-TEMPO-FI-FA(實驗組)溶液,濃度分別是3.0mM及單純培養(yǎng)基設(shè)定為空白組。培養(yǎng)2h后,用多聚甲醛固定細(xì)胞并用DAPI染細(xì)胞核,洗滌三次。爬片置于載玻片上,甘油封片后,置于熒光顯微鏡下觀察。 3.1.4體外細(xì)胞MRI成像 將Hela細(xì)胞懸液接種于6孔板中(2×104個/孔)中,培養(yǎng)48小時后加入PA-TEMPO-FI(對照組)或PA-TEMPO-FI-FA(實驗組)溶液,濃度為0-5.0mM;單純培養(yǎng)基設(shè)定為空白組。培養(yǎng)4h后,取出細(xì)胞離心后用0.1%瓊脂糖凝膠混勻,置于塑料架上進行3.0T磁共振掃描,采用8通道頭部線圈,掃描序列采用T1WI,隨后測量各個濃度試管中部T1信號值及背景信號值,計算樣品的信號噪聲比。 第二節(jié)新型有機自由基磁共振造影劑的體內(nèi)研究 3.2材料與方法 3.2.1裸鼠腫瘤模型的建立： 取O.1mL(5x106個)Hela細(xì)胞懸液,接種在BALB/c裸鼠右側(cè)肩背部皮下,飼養(yǎng)并定期觀察,待腫瘤直徑達(dá)1-2cm,即可開始后續(xù)實驗。 3.2.2磁共振靶向?qū)Ρ葎㏄A-TEMPO-FI-FA在腫瘤裸鼠中的活體熒光觀察與組織分布研究； 實驗時,用0.3%戊巴比妥鈉對裸鼠進行腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉劑量約為0.3-0.5mL(裸鼠體重25-30克),經(jīng)鼠尾靜脈注入制備的靶向?qū)Ρ葎㏄A-TEMPO-FI-FA溶液(PBS為溶劑),造影劑的濃度全部為5mM,每只小鼠藥量約為2.5mmol,注射0.5mL；注射前及注射成功后不同時間點進行裸鼠活體熒光顯像。為了進一步分析PA-TEMPO-FI-FA在體內(nèi)的不同器官的生物分布,在注射藥物后3h處死裸鼠,取出并分離器官,用生理鹽水徹底沖洗后干凈后進行體外組織分布熒光成像分析。 3.2.3磁共振靶向?qū)Ρ葎㏄A-TEMPO-FI-FA在腫瘤裸鼠體內(nèi)的MRI研究： 實驗時,用0.3%戊巴比妥鈉對裸鼠進行腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉劑量約為0.3-0.5mL(裸鼠體重25-30克),然后固定裸鼠,采用仰臥位成像,用GE3.0T超導(dǎo)高場MR掃描儀,老鼠用動物線圈,SE序列T1WI橫斷面和冠狀面掃描。MRI掃描參數(shù)為：SE序列、T1WI,TR=540ms,TE=10.7ms,層厚3mm(冠狀面),FOV=12×12mm,矩陣=320X224。在完成平掃后,用1.0ml注射器經(jīng)鼠尾靜脈注入制備的靶向?qū)Ρ三R(?)PA-TEMPO-FI-FA溶液(PBS為溶劑),造影劑的濃度全部為5mM,每只小鼠藥量約為2.5nmol,注射0.5ml；注射成功后,追加麻藥,再次將裸鼠與平掃相同體外位固定于掃描器中,行各時間點掃描。觀察模型注射前及注射后2h點瘤體T1WI信號值變化情況。 實驗動物數(shù)據(jù)依次從PACS工作站中轉(zhuǎn)移到處理電腦,并使用MATLAB軟件(The Math-Works, Natick, MA,USA)對數(shù)據(jù)進行處理,采用Microsoft VisualC++編輯圖像處理程序并應(yīng)用于MATLAB軟件中。感興趣區(qū)通過描繪T1WI上每個層面的腫瘤輪廓覆蓋整個腫瘤,應(yīng)用軟件對包含腫瘤的圖像進行整合計算獲得每個像素點對應(yīng)的像素信號值。以腫瘤增強前的像素分布為基線建立腫瘤平均信號值和標(biāo)準(zhǔn)差,各時間點的圖像都經(jīng)過相同的數(shù)據(jù)處理過程,高于基線平均信號值標(biāo)準(zhǔn)差以上的像素點,我們認(rèn)為是腫瘤強化部分,由此依次處理實驗動物(n=5),最后應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包,采用配對樣本t檢驗(Paired-Samples T Test)比較實驗裸鼠腫瘤組織平掃及注射PA-TEMPO-FI-FA造影劑2小時后信號強度改變是否有顯著性差異。P0.05則認(rèn)為有顯著性差異。 3.2.4熒光免疫組織化學(xué) MR掃描結(jié)束后即行頸椎脫臼法處死裸鼠,并快速取其腫瘤組織,固定,包埋,并行冰凍切片觀察腫瘤組織內(nèi)熒光顯像。 3.2.5正常裸鼠對PA-TEMPO-FI-FA造影劑急性毒性試驗 正常裸鼠分為對照組和實驗組,分別注射生理鹽水和PA-TEMPO-FI-FA溶液后觀察裸鼠一般狀況,2天后處死并進行HE染色組織器官病理學(xué)檢查。 3.3結(jié)果 3.3.1新型有機自由基磁共振造影劑細(xì)胞毒性的評估 MTT法測定細(xì)胞存活率結(jié)果表明。在濃度小于5mM時,在誤差范圍內(nèi)PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA三種藥物的細(xì)胞毒性相當(dāng),三種造影劑作用下細(xì)胞存活均在80%以上；但隨著培養(yǎng)液中藥物濃度的增加,兩組Hela細(xì)胞生存率均有下降的趨勢。PA-TEMPO-FI-FA組藥物的細(xì)胞毒性較PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI組低；即使是高濃度組(10mM),細(xì)胞生存率也在80%左右,其毒性明顯低于PA-TEMPO。這表明PA-TEMPO-FI-FA有良好的生物安全性。三種藥物對細(xì)胞毒性影響的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.3.2新型有機自由基磁共振造影劑T1信號強度與T1弛豫率的評估 隨之PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA濃度增加,T1信號值逐漸增強,相同濃度下,PA-TEMPO較PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA組的信號值稍高。從T1加權(quán)圖像及相應(yīng)偽彩圖上也可以看出,濃度越高,信號越強,并PA-TEMPO組比PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA組的強化效果稍明顯。稀釋在PBS中的不同濃度PA-TEMPO、PA-TEMPO-FI和PA-TEMPO-FI-FA的T1mapping T1值測定結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增加,三組藥物的T1值都逐漸下降。以藥物濃度(mM)為橫坐標(biāo)(X),相應(yīng)1/T1為縱坐標(biāo)(Y)作圖,在1-10mM濃度范圍內(nèi)三種藥物的線性關(guān)系良好。直線方程的斜率為T1弛豫率,分別為0.27mmol-1s-1、0.23mmol-1s-1及0.20mmol-1s-1。PA-TEMPO、 PA-TEMPO-FI的弛豫率稍高于PA-TEMPO-FI-FA,PA-TEMPO的弛豫率最高。 3.3.3新型有機自由基磁共振造影劑細(xì)胞攝取評估 熒光顯微鏡觀察體外Hela細(xì)胞攝取,用DAPI進行核染：空白組與含PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液Hela細(xì)胞孵化2h后爬片熒光顯微鏡觀察；與空白組相比,對照組與實驗組Hela(?)細(xì)胞內(nèi)可見不同程度的綠色熒光在藍(lán)染的細(xì)胞核周圍,實驗組(PA-TEMPO-FI-FA)較對照組(PA-TEMPO-FI)能被Hela細(xì)胞明顯攝取更多,說明合成的葉酸修飾后,配體受體特異性結(jié)合有利于PA-TEMPO-FI-FA被腫瘤細(xì)胞高效攝取,也驗證了PA-TEMPO-FI-FA(?)能有效地靶向葉酸受體陽性的腫瘤細(xì)胞。 3.3.4新型有機自由基磁共振造影劑體外細(xì)胞MRI評估 體外Hela細(xì)胞攝取后MRI成像進一步驗證PA-TEMPO-FI-FA的應(yīng)用潛力�？瞻捉M與含不同濃度PA-TEMPO-FI及PA-TEMPO-FI-FA溶液Hela細(xì)胞孵化4h后MRI成像觀察；與空白組相比,對照組和實驗組Hela細(xì)胞用0.1%瓊脂糖混勻后MRI T1加權(quán)成像,對照組和實驗組較空白組均有信號強度改變,但可見相同濃度條件下,實驗組(PA-TEMPO-FI-FA)較對照組(PA-TEMPO-FI)信號強度明顯增加,并隨著濃度增強(0-5mM),信號增強顯著。實驗結(jié)果表明靶向PA-TEMPO-FI-FA能被細(xì)胞攝取,并在體外細(xì)胞MRI成像中檢測到信號的增強。 3.3.5靶向磁共振造影劑PA-TEMPO-FI-FA在腫瘤裸鼠中的活體熒光與組織分布評價； 尾靜脈注射PA-TEMPO-FI-FA溶液后不同時間點進行活體熒光成像。注射30min后,可見裸鼠體內(nèi)有豐富的熒光分布,范圍較廣,而腫瘤區(qū)域尚未見明顯熒光顯像；到1h時,腫瘤區(qū)域可見與其他部位相同熒光強度分布；1.5h時,可見腫瘤區(qū)域與腹部區(qū)域明顯熒光聚集；2h時,可見藥物在腫瘤區(qū)域明顯特異性熒光增強；2.5h后仍可見裸鼠腫瘤區(qū)域熒光富集,但較2h稍減弱,其他區(qū)域熒光基本消失。從結(jié)果可以看出我們合成的葉酸靶向有機自由基PA-TEMPO-FI-FA造影劑的特異性,能有效實現(xiàn)藥物在葉酸過表達(dá)的腫瘤內(nèi)較豐富及長效的聚集。 3.3.6新型有機自由基磁共振對比劑PA-TEMPO-FI-FA在腫瘤裸鼠中的MRI成像評估 注射前及尾靜脈注射PA-TEMPO-FI-FA溶液后不同時間點進行活體MRI成像。腫瘤區(qū)域可以看到信號逐漸增強,峰值出現(xiàn)在2h。數(shù)據(jù)處理后進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果顯示裸鼠皮下移植型宮頸癌腫瘤組織平掃及增強后2h的信號增強差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。體內(nèi)MRI結(jié)果表明,新型有機自由基磁共振造影劑PA-TEMPO-FI-FA能有效靶向葉酸過表達(dá)的腫瘤,實現(xiàn)腫瘤MRI信號顯著增強效應(yīng)。 3.3.7裸鼠腫瘤組織免疫熒光組織化學(xué)評估 冰凍切片熒光顯微鏡下可見腫瘤細(xì)胞核藍(lán)染,周圍可見豐富的綠色熒光圍繞,證明綠色熒光素FI標(biāo)記的靶向有機自由基造影劑到達(dá)腫瘤部位,并能有效地在腫瘤組織中富集。 3.3.8正常裸鼠對PA-TEMPO-FI-FA的急性毒性試驗評估 對照組與實驗組裸鼠處死前兩天內(nèi)一般狀況良好；HE染色病理組織檢查對照組與實驗組腦、心、肺、肝、脾、腎六個器官,結(jié)果證明對照組與實驗組皆未顯示明顯的病變區(qū)域,未見有明顯的腦、心、肺、肝、脾、腎毒性。結(jié)論 基于順磁性有機自由基TEMPO的MRI T1弛豫特性,應(yīng)用我們合成的新型有機自由基靶向MR比劑——PA-TEMPO-FI-FA可初步實現(xiàn)動物腫瘤組織的主動靶向性MR顯像。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R445.2

【參考文獻】

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1 駱少明,張湘?zhèn)?蔡永昌;THE VARIATIONAL PRINCIPLES AND APPLICATION OF NONLINEAR NUMERICAL MANIFOLD METHOD[J];Applied Mathematics and Mechanics(English Edition);2000年12期

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本文編號：1521213