本文關(guān)鍵詞：凋亡通路機制在肺癌和骨肉瘤輻射抗性中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

凋亡通路機制在肺癌和骨肉瘤輻射抗性中的作用研究

趙馮均  

【摘要】：放射治療是治療惡性腫瘤的有效手段之一，電離輻射可直接殺死腫瘤細胞，或誘導(dǎo)其凋亡及自噬的發(fā)生。凋亡是細胞受到外界因素作用后發(fā)生的一種程序性細胞死亡，國內(nèi)外學(xué)者對細胞凋亡的研究較多且較為深入。凋亡過程涉及多種通路，包括內(nèi)源性凋亡通路（即線粒體凋亡通路），外源性凋亡通路（即死亡配體/受體通路），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路及自噬等，各通路之間可互相影響，如外源性及內(nèi)源性通路間可相互交叉，進而放大凋亡效應(yīng)。 目前，對惡性腫瘤的研究多集中在藥物對腫瘤細胞的作用或腫瘤細胞的輻射增敏劑作用，，而關(guān)于不同輻射敏感性的腫瘤細胞，特別是具有輻射抗性的惡性腫瘤凋亡機制的研究較少。本研究旨在探索輻射抗性腫瘤細胞凋亡通路的分子機制，為提高腫瘤放療療效提供理論依據(jù)。 研究目的： 觀察輻射作用后的肺癌和骨肉瘤細胞凋亡通路相關(guān)分子的表達變化，闡明輻射抗性腫瘤細胞的凋亡機制。 研究方法： 選取非小細胞肺癌細胞系（輻射抗性的A549和輻射敏感的H460）和骨肉瘤細胞系（HOS）進行實驗，并利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染方法建立shNRP1-A549穩(wěn)定表達細胞模型，采用流式細胞術(shù)檢測電離輻射作用后腫瘤細胞的凋亡率及周期進程，進一步應(yīng)用qRT-PCR及Western blot法檢測細胞凋亡相關(guān)分子的mRNA及其蛋白水平變化，探討凋亡通路在輻射抗性腫瘤細胞中的作用機制。 研究結(jié)果： 1.輻射抗性腫瘤細胞受照后凋亡率和細胞周期進程的變化 10Gy X射線照射后A549、H460、HOS及shNRP1-A549細胞與假照組相比凋亡率均增加，輻射敏感的H460細胞及shNRP1-A549細胞凋亡率明顯高于A549和HOS細胞，說明A549和HOS細胞具有較高的輻射抗性。細胞周期進程的結(jié)果顯示，A549和shNRP1-A549細胞受照后G2/M期比例較假照組升高，且shNRP1-A549細胞的升高變化較親本A549細胞更明顯，說明干擾NRP1基因表達后，出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，增強對輻射的敏感性。 2.輻射抗性腫瘤細胞中內(nèi)源性凋亡通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化 10Gy X射線作用后，A549細胞Caspase-9基因轉(zhuǎn)錄水平高于假照組，HOS細胞卻有所下降但變化不顯著，而shNRP1-A549和H460細胞Caspase-9基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于假照組。促凋亡基因Bax轉(zhuǎn)錄水平在受照后的A549及H460細胞中均升高，但具有輻射抗性的A549細胞中升高幅度只是假照組的2-3倍，HOS細胞中的轉(zhuǎn)錄水平低于假照組，而在H460細胞中升高幅度達到假照組的35倍。抗凋亡基因Bcl-xL轉(zhuǎn)錄水平在輻射抗性A549及HOS細胞中升高，而在輻射敏感的H460細胞中無明顯變化。本實驗結(jié)果表明，電離輻射可通過激活輻射抗性腫瘤細胞的內(nèi)源性凋亡通路，但其凋亡通路中的促凋亡基因的升高程度低于輻射敏感的細胞，在其過程中起關(guān)鍵作用的是抗凋亡基因Bcl-xL。 在10Gy X射線作用后，內(nèi)源性凋亡通路相關(guān)蛋白水平變化與轉(zhuǎn)錄水平變化不完全一致，H460細胞的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達水平高于假照組，而在HOS細胞中卻幾乎不表達，在shNRP1-A549細胞中的表達變化不明顯,但在A549細胞中Bcl-xL的mRNA及蛋白表達水平均高于假照組；shNRP1-A549中促凋亡基因Bax的mRNA及蛋白表達水平均高于假照組，但其蛋白表達水平較親本A549細胞低。說明輻射抗性腫瘤細胞的凋亡機制中，內(nèi)源性凋亡通路蛋白可能在轉(zhuǎn)錄后水平上進行調(diào)控。 3.輻射抗性腫瘤細胞中外源性凋亡通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化 10Gy X射線作用后，在外源性凋亡通路基因在輻射抗性腫瘤細胞中表達變化具有細胞特異性，即肺癌細胞與骨肉瘤細胞中的表達變化并不一致，但在肺癌細胞中具有輻射抗性的A549細胞和輻射敏感性高的H460細胞中Caspase-8和Caspase-6基因表達變化卻相反，而Caspase-3的轉(zhuǎn)錄水平變化是一致的。說明在肺癌細胞輻射抗性中外源性凋亡通路起重要作用，而在輻射不敏感性的骨肉瘤（HOS）細胞中卻沒有明顯的作用。10Gy X射線作用后，外源性凋亡通路相關(guān)蛋白在輻射抗性腫瘤細胞中表達變化與轉(zhuǎn)錄水平的變化基本一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾輻射抗性相關(guān)基因——NRP1以后，受照射的shNRP1-A549細胞中外源性凋亡相關(guān)蛋白表達變化與輻射敏感度的H460細胞中的變化相似，進一步證實外源性凋亡機制在肺癌細胞輻射抗性中起重要作用。 4.輻射抗性腫瘤細胞中凋亡相關(guān)的酶類基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化 本實驗檢測凋亡相關(guān)的酶類的表達變化，探討其機制。研究發(fā)現(xiàn)，10Gy X線作用后，在輻射抗性A549及HOS細胞中，PARP的轉(zhuǎn)錄水平較一致，在H460細胞中該基因的轉(zhuǎn)錄水平較假照組低。PARP蛋白及Cleaved PARP蛋白在輻射抗性A549及HOS細胞中的表達趨勢較一致，在H460細胞中PARP蛋白的表達明顯降低，Cleaved PARP蛋白的表達明顯升高。敲低NRP1的表達后，A549細胞中的Cleaved PARP蛋白未表達，而親本A549細胞中Cleaved PARP蛋白高于假照組，shNRP1-A549細胞中PARP蛋白的表達較親本A549細胞低。表明干擾NRP1的表達后，PARP基因的表達受到抑制，并且PARP蛋白未發(fā)生剪切，從而使細胞對電離輻射更加敏感，此結(jié)果說明DNA修復(fù)蛋白酶PARP在輻射抗性腫瘤細胞的凋亡機制中起重要作用。MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄水平在輻射抗性及輻射敏感性細胞中均增高，但其蛋白表達水平卻較假照組略降低，該基因轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上的差異表明該蛋白的表達在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控，輻射抗性及輻射敏感性細胞中MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的變化一致，表明MMP-2基因與腫瘤細胞的輻射抗性無明顯關(guān)聯(lián)。 結(jié)論： 1.10Gy X射線照射后輻射抗性的肺癌細胞和輻射不敏感的骨肉瘤細胞凋亡率雖然高于假照組，但其升高幅度低于輻射敏感的肺癌細胞。 2.在輻射抗性腫瘤細胞的凋亡過程中，內(nèi)源性凋亡通路相關(guān)分子Caspase-9及Bax和抗凋亡蛋白Bcl-xL起關(guān)鍵作用。 3.在輻射抗性肺癌細胞中外源性凋亡通路相關(guān)分子Caspase-6起重要作用，而Caspase-8及Caspase-3的作用不明顯。 4.在輻射抗性腫瘤細胞中凋亡相關(guān)的酶類PARP活性受抑制,而MMP-2基因與蛋白表達變化與腫瘤細胞的輻射抗性無明顯關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2;R738.1;R730.55
【目錄】：

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