本文關(guān)鍵詞：載紫杉醇靶向磁性納米探針雙模態(tài)顯像及治療乳腺癌的實驗研究

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【摘要】：第一部分 載紫杉醇靶向磁性納米探針的制備及性能目的1.制備一種新型智能探針載紫杉醇靶向磁性納米探針(Paclitaxel-loaded targeted magnetic nanoprobe, PTX-USPIO-HER-NBs),并對其基本性質(zhì)進行檢測。2.探討載紫杉醇靶向磁性納米探針體外細胞尋靶能力及對細胞活性的影響方法1.以PEG化端羧基PLGA作為成膜材料,采用雙乳化法及碳二亞胺化學(xué)連接法,制備裝載不同含量超小型超順磁性氧化鐵(Ultasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)的PTX-USPIO-HER-NBs探針,并對其粒徑、電位、表面形態(tài)、載鐵量等進行檢測；用振動樣品磁強計檢測其磁學(xué)性能；采用高效液相色譜法檢測探針中紫杉醇的包封率及載藥量,連續(xù)觀察30天內(nèi)體外藥物釋放特征；免疫熒光法檢測Herceptin是否成功連于探針表面,并用BCA蛋白濃度檢測探針表面曲妥珠單抗連接量。2.體外培養(yǎng)高表達HER2的乳腺癌細胞株SK-BR-3與低表達細胞株MDA-MB-231,觀察超聲輻照對靶向探針與細胞結(jié)合能力的影響,并設(shè)置Herceptin干預(yù)組及非靶向探針組進行對照,評價其體外尋靶能力。CCK8法檢測所制備探針對細胞活性的影響,并設(shè)置多組對照,對探針各種成分的細胞毒性進行探討。結(jié)果1.光鏡及掃描電鏡觀察所制備探針形態(tài)規(guī)則,呈球形,表面光滑,分散性好,大小較均勻,粒徑約285.8±98.97nm,較非靶向探針粒徑偏大。透射電鏡結(jié)果顯示探針為殼核結(jié)構(gòu),USPIO分布于殼膜中,且其分布具有隨機性,隨著制備時USPIO投入量的增加,USPIO在殼膜上的裝載量增加,但包封率降低。VSM顯示PTX-USPIO-HER-NBs具有超順磁性和強磁性。HPLC法測得探針中紫杉醇的包封率為(69.24±0.05)%,載藥量為(6.92±0.13)%,觀察在體外30天內(nèi)具有良好的緩釋性能,在超聲輻照下可加快藥物的釋放。免疫熒光法結(jié)果顯示靶向探針組因FITC標(biāo)記二抗的結(jié)合而顯示綠色熒光,BCA蛋白濃度檢測Herceptin表現(xiàn)連接量為14±0.037mg/g探針。2.體外細胞尋靶實驗顯示超聲輻照下,靶向探針不僅附著于SK-BR-3細胞表面,細胞漿內(nèi)亦見較多探針分布,視野內(nèi)平均每個細胞結(jié)合探針熒光強度為3345.76±141.96,遠遠高于非輻照組、Herceptin干預(yù)組及非靶向組。CCK8法結(jié)果顯示,PTX-USPIO-HER-NBs在超聲輻照下對SK-BR-3的細胞毒性最大,高分子材料及USPIO對細胞活性影響不大,具有良好的安全性。結(jié)論所制備的探針具有良好的載紫杉醇及USPIO的能力,表面可經(jīng)抗體修飾而具有靶向性,在體外對HER2受體高表達SK-BR-3細胞有良好的尋靶向能力,并對該細胞有特異性的毒殺效能。目的觀察PTX-USPIO-HER-NBs體外增強磁共振、超聲的效果,探討其作為雙模式顯像劑的可行性；于體內(nèi)實驗觀察PTX-USPIO-HER-NBs對裸鼠SK-BR-3移植瘤US/MRI雙模式成像效果,了解PTX-USPIO-HER-NBs增強US/MRI的能力及原理。方法1.配置不同鐵濃度的PTX-USPIO-HER-NBs懸液,應(yīng)用1.5T磁共振掃描儀采集FSPGR-T2*WI圖像,測得各樣品的R2*值,評價所制備探針負性強化效果。配置不同NBs濃度的PTX-USPIO-HER-NBs,應(yīng)用超聲診斷儀采集Bmode及造影模式圖像,并利用DFY分析各濃度的灰階強度。2.建立裸鼠SK-BR-3移植瘤模型,選擇15只隨機分為三組,分別經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水、PTX-USPIO-NBs及PTX-USPIO-HER-NBs。采用小動物線圈經(jīng)3.0T磁共振采集不同時間點的T2WI圖像,測量各時間點增強前后同一層面裸鼠腫瘤及大腿肌肉感興趣區(qū)的信號強度值(Signal intensity, SI) SItumor及SImuscle,計算相對信號強度(Relative signal intensity, Sir)及信號強度降低率(Percentage of signal intensity loss, PSIL)。同樣的分組方法,利用PanoViewβ1500高頻超聲顯像儀的造影模式進行超聲顯影實驗。造影前平掃100幀圖像作為造影前對照圖像,注射造影劑后繼續(xù)采集1000幀,采集時間在不少于60min。選擇圖像上腫瘤感興趣區(qū)(Region of interesting, ROI),繪制隨時間變化的回聲增強強度曲線圖(Time intensity curve, TIC),隨時間變化的視頻強度曲線圖(Video intensity curve, VIC),在該軟件是指造影前后在腫瘤內(nèi)呈現(xiàn)的探針?biāo)及俜直?比較各組造影前后在圖像灰度增強值(Gary scaleintensity, GSI)及視頻強度增加率(Percentage of video intensity, VI%)上的差異。結(jié)果1.體外磁共振顯影結(jié)果顯示,所制備PTX-USPIO-HER-NBs磁性探針的T2*信號強度隨著鐵濃度的增加而降低,隨著樣品鐵含量的增加,其信號降低百分比(PSIL)逐漸增加；橫向弛豫率R2*與鐵濃度間存在著線性關(guān)系。體外超聲顯影結(jié)果顯示,隨著NBs濃度的增加,樣品顯示為回聲強度逐漸增高,回聲呈點狀,細小,均勻,造影模式下造影效果也逐漸增強。載鐵探針與非載鐵探針相比,前者回聲強度明顯高于后者,p0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.SK-BR-3移植瘤裸鼠模型體內(nèi)MR成像的研究結(jié)果表明,生理鹽水組注射前后,腫瘤信號強度無明顯變化,不同時間點信號強度降低百分比(PSIL)相比,p0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；非靶向探針PTX-USPIO-NBs和靶向探針PTX-USPIO-HER-NBs經(jīng)尾靜脈注射后,首先可觀察到肝臟信號強度降低；隨掃描時間延長,腫瘤組織的信號強度逐漸降低,靶向探針組較非靶向探針組降低更為明顯,p0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。體內(nèi)增強超聲結(jié)果顯示生理鹽水對照組于造影前后圖像回聲強度未見明顯變化；與生理鹽水對照組比較,非靶向探針組與靶向探針組圖像回聲強度均有增強；靶向探針組與非靶向探針組比較,GSI與Ⅵ%均明顯增高,p0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論PTX-USPIO-HER-NBs在體外能夠增強超聲、磁共振顯像。體內(nèi)實驗中,PTX-USPIO-HER-NBs可靶向聚集于腫瘤組織,具有增強乳腺癌超聲、磁共振雙模式成像的能力,同時攜載紫杉醇可進一步實現(xiàn)影像引導(dǎo)下的可視化治療,為乳腺癌的診斷與治療提供了一種新的思路。目的探討PTX-USPIO-HER-NBs在裸鼠各臟器內(nèi)的分布；進一步聯(lián)合超聲促進藥物釋放對裸鼠SK-BR-3移植瘤的治療效果。方法1.選取10只SK-BR-3移植瘤裸鼠進行小動物活體成像,隨機分為兩組：非靶向探針(DiI/PTX-USPIO-NBs)組和靶向探針(DiI/PTX-USPIO-HER-NBs)組,每組5只,經(jīng)尾靜脈緩慢注射探針,每只注射用量為05ml (10mg/ml)。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,小動物活體熒光成像儀采集圖像并對比觀察各處理組腫瘤局部的熒光強度,利用Maestro軟件系統(tǒng)對圖像進行定量分析。2.選5只荷雙瘤裸鼠模型,右側(cè)腫瘤給予超聲輻照,左側(cè)腫瘤作為對照不用超聲輻照,經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)DiI標(biāo)記的靶向探針24小時后,斷頸處死裸鼠,將腫瘤組織、腦組織、肝臟、脾臟、腎臟及肺臟取出,迅速送到病理科做成冰凍切片。DAPI染色后,激光共聚焦顯微鏡下觀察各臟器內(nèi)熒光分布情況,并定量峰每張圖片的積分光密度值(integrated optical density, IOD)。3.選取25只裸鼠SK-BR-3移植瘤模型,隨機分為5組進行實驗,分別為生理鹽水對照組(contr。1)、單純紫杉醇藥物組(PTX)、非靶向探針組(PTX-USPIO-NBs)、靶向探針組(PTX-USPIO-HER-NBs)和靶向探針+超聲輻照組(PTX-USPIO-HER-NBs+US)。每只裸鼠紫杉醇用量為25mg/kg。根據(jù)探針?biāo)幬镙d藥量調(diào)整為相應(yīng)的含藥濃度。各組給予相對應(yīng)藥物濃度,治療間隔3天,共3次。定期測量腫瘤體積大小,于治療后剝?nèi)∧[瘤組織,稱取質(zhì)量,計算腫瘤抑瘤率(Tumor inhibition rate, TIR)。用免疫組化法檢測腫瘤組織PCNA、CD34的表達,計算細胞增殖指數(shù)(Proliferation index, PI)和微血管密度(Microvessel density, MVD), TUNEL法檢測腫瘤細胞的凋亡,計算腫瘤細胞凋亡指數(shù)(Apoptotic index, AI)。結(jié)果1.小動物活體熒光成像結(jié)果顯示非靶探針組在腫瘤內(nèi)部幾乎觀察不到熒光；靶向探針組可見經(jīng)DiI標(biāo)記的靶向探針在腫瘤內(nèi)部聚集發(fā)出紅色熒光。Maestro軟件系統(tǒng)分析熒光強度見靶向探針組熒光強度明顯高于非靶向組,p0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.激光共聚焦顯微鏡觀察各臟器冰凍切片結(jié)果顯示,裸鼠腫瘤及肝、脾、腎、肺、腦組織中均含有不同濃度的對比劑,24h后肝臟內(nèi)探針熒光強度與超聲輻照側(cè)腫瘤相比,P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。超聲輻射側(cè)腫瘤內(nèi)的熒光明顯高于非輻射側(cè)腫瘤,兩者相比P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。裸鼠體內(nèi)其他臟器的熒光強度分布程度也各不相同,以肝、脾分布最多,腦組織分布最少。3.分組治療結(jié)果顯示,PTX-USPIO-HER-NBs+US組腫瘤體積生長最慢,質(zhì)量抑瘤率最高,治療效果優(yōu)于其他組。TUNEL法檢測PTX-USPIO-HER-NBs+US組腫瘤細胞凋亡指數(shù)顯著高于其他治療組；免疫組化法測得PTX-USPIO-HER-NBs+US組的增殖指數(shù)明顯高于其他組；微血管密度最小,明顯低于其他組(P0.05)。結(jié)論所制備PTX-USPIO-HER-NBs探針聯(lián)合超聲輻照可增強其在SK-BR-3移植瘤內(nèi)的聚集,所攜帶藥物在腫瘤組織內(nèi)緩慢釋放,可以抑制癌細胞的細胞增殖,促進其凋亡。PTX-USPIO-HER-NBs是一種有應(yīng)用前景的集顯像與治療為一體的多功能分子探針。
【關(guān)鍵詞】：探針 USPIO 紫杉醇 靶向 Herceptin 乳腺癌 探針 高頻 超聲 磁共振成像 紫杉醇 治療 靶向 乳腺癌 納米探針
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R445.2;R737.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-15
• 英文摘要15-27
• 前言27-33
• 參考文獻30-33
• 第一部分 載紫杉醇靶向磁性納米探針的制備及性能檢測33-66
• 前言33
• 第一節(jié) 載紫杉醇靶向磁性納米探針制備及表征33-51
• 1 材料和設(shè)備33-37
• 2 結(jié)果37-41
• 3 討論41-44
• 參考文獻44-47
• 附圖47-51
• 第二節(jié) 載紫杉醇靶向磁性納米探針體外尋靶及細胞毒性實驗51-66
• 1 材料與設(shè)備51-53
• 2 結(jié)果53-57
• 3 討論57-60
• 參考文獻60-63
• 附圖63-66
• 第二部分 載紫杉醇靶向磁性納米探針增強超聲/磁共振雙模式顯像實驗研究66-85
• 前言66-67
• 1 材料與儀器設(shè)備67-68
• 2 實驗方法68-70
• 3 結(jié)果70-73
• 4 討論73-78
• 參考文獻78-82
• 附圖82-85
• 第三部分 載藥靶向磁性探針體內(nèi)生物學(xué)分布及治療裸鼠乳腺癌85-105
• 前言85
• 1 材料與儀器85-86
• 2 實驗方法86-88
• 3 結(jié)果88-93
• 4 討論93-96
• 參考文獻96-99
• 附圖99-105
• 全文總結(jié)105-107
• 文獻綜述107-115
• 參考文獻111-115
• 致謝115-117
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、參研項目、學(xué)術(shù)交流目錄117

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