本文關鍵詞：β-catenin對大鼠髖脫位關節(jié)軟骨細胞增殖和凋亡影響的實驗研究

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【摘要】：[背景和目的] 發(fā)育性髖關節(jié)脫位(Developmental dislocation of the hip, DDH)是小兒矯形外科最常見的疾病之一,由于早期篩查工作的開展,大部分患兒能獲得及時的治療,但仍有部分患兒在治療過程中出現(xiàn)再脫位、殘余髖發(fā)育不良(Residual acetabular Dysplasia RAD),以致成年后早期出現(xiàn)退行性骨關節(jié)炎(Osteoarthritis OA),最終進行全髖關節(jié)置換(Total hip arthroplasty, THA),降低了他們的生活質量。骨關節(jié)炎的實質是關節(jié)軟骨發(fā)生退變,一般主要包括兩方面,一方面細胞外基質的合成和降解代謝失衡；另一方面軟骨細胞的增殖和凋亡發(fā)生變化。目前對于DDH早期發(fā)生關節(jié)軟骨退行性變的細胞和分子機制仍不清楚。近來有研究表明β-catenin介導的Wnt通路在關節(jié)軟骨的發(fā)育、增殖、分化、凋亡以及維持內環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著關鍵作用。本課題組在前期實驗研究發(fā)現(xiàn)β-catenin對關節(jié)軟骨起著雙向調節(jié)的作用,主要表現(xiàn)對于正常軟骨在早期關節(jié)發(fā)育階段,β-catenin主要是激活促進關節(jié)軟骨分化成熟,軟骨發(fā)育成熟后β-catenin表達迅速降低；但在髖脫位關節(jié)軟骨中隨著發(fā)育成熟β-catenin的表達繼續(xù)升高,促進了關節(jié)軟骨發(fā)生退行性改變,推測關節(jié)軟骨發(fā)生退變可能與β-catenin激活后導致X型膠原(Col X)以及基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase MMPs)的表達上調有關。正常情況下,軟骨細胞是軟骨組織內唯一的細胞類型,它在軟骨基質損傷及重塑過程中對維持內環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用,但在關節(jié)軟骨退變過程中β-catenin對軟骨細胞的增殖、凋亡的調控尚未見相關報道。因此,本文擬通過動物實驗來模擬髖脫位的自然進程,探討關節(jié)軟骨在退變過程中β-catenin對軟骨細胞增殖和凋亡的調控作用,為進一步深入研究DDH發(fā)生退變的分子機制提供新思路。 [方法] 1.60只新生Wistar大鼠隨機分成實驗組(n=30)和對照組(n=30),雌雄不限,體重均等。并按鼠齡分為2周齡組(n=10)、4周齡組(n=10)、8周齡組(n=10),對照組按照類似方法進行分組。實驗組大鼠模擬襁褓體位采用醫(yī)用膠帶對雙髖雙膝伸直并攏固定10天制作髖脫位動物模型,然后去除外固定后繼續(xù)飼養(yǎng)。每組達到預期時間進行取材進行實驗。其中一側髖關節(jié)經過固定、脫鈣從冠狀面剖開拍照存檔用于測量臼深指數(shù)以及股骨頭形態(tài)指數(shù),然后制成切片進行番紅O-固綠染色和β-catenin免疫組化染色,高倍鏡下隨機取五個不同視野觀察組織形態(tài)變化以及β-catenin在不同時段關節(jié)軟骨中的表達,并進行Mankin評分評估軟骨退變程度。 2.另一側髖關節(jié)用于提取關節(jié)軟骨細胞進行原代培養(yǎng),Ⅱ型膠原免疫熒光及甲苯胺藍染色鑒定,采用CCK-8、流式分析細胞周期,檢測兩組在不同時段的增殖能力與凋亡情況； 3.對8周齡對照組貼壁軟骨細胞進行LiCl干預,激活β-catenin表達,免疫熒光檢測β-catenin;重復CCK-8、流式細胞分析檢測軟骨細胞的增殖能力、細胞周期以及凋亡的改變；TUNEL免疫熒光法檢測凋亡率。 4.所有體外細胞實驗均重復三次,數(shù)據以均數(shù)±標準差(X±SD)表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,t檢驗進行統(tǒng)計學分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 [結果] 1、動物模型制作以及大體形態(tài)觀察：實驗過程中,2周齡組松脫一只予以剔除,死亡一只。去除外固定后同籠喂養(yǎng),大鼠體重與身長與對照組相比無明顯差異。實驗組的大體標本均可見股骨頭脫出于髖臼外,證實建模成功(建模成功率93.3%)；且隨著生長發(fā)育,股骨頭未能獲得復位,關節(jié)囊增厚,髖臼口變小,臼內有軟組織嵌入,股骨頭明顯扁平,與髖臼嚴重不匹配。盡管實驗組臼深指數(shù)以及股骨頭形態(tài)指數(shù)顯示較對照組發(fā)育小,但隨鼠齡增加仍呈發(fā)育增大趨勢；8周齡時髖臼發(fā)育基本停止,頭臼不對稱進一步加重(P0.05)。 2、病理組織形態(tài)觀察以及Mankin評分：番紅／固綠染色可見到對照組隨著生長發(fā)育,關節(jié)軟骨形態(tài)呈球形,且軟骨層次清楚,逐漸變薄;實驗組在4周齡關節(jié)軟骨變形明顯,淺層部分染色變淺,出現(xiàn)軟骨細胞排列紊亂,局部聚集成簇、纖維化,8周齡時番紅失染范圍擴大,淺層軟骨細胞消失,殘留陷窩,可見較多裂隙,移行層細胞明顯增生成簇。Mankin評分在2周齡時兩組沒有顯著差異(P0.05),4、8周齡時實驗組顯著高于對照組(P=0.000),且實驗組成逐漸上升趨勢。P-catenin:免疫組織化學中可見β-catenin在對照組大鼠2周時表達較多,4周時表達明顯增加,隨鼠齡增長表達逐漸下降,8周時表達很弱；而在實驗組β-catenin表達無下降趨勢,且隨著生長發(fā)育持續(xù)高表達。 3、體外細胞培養(yǎng)形態(tài)以及鑒定：軟骨細胞培養(yǎng)及鑒定：軟骨細胞培養(yǎng)后Ⅱ型膠原免疫熒光及甲苯胺藍染色鑒定為軟骨細胞。 4、不同時段軟骨細胞增殖和凋亡的改變增殖速率在2周齡時：實驗組(0.86)比對照組(0.75)快15.1%；4周齡時：實驗組(1.14)比對照組(0.92)快24.6%;8周：實驗組(0.78)比對照組(0.64)快21.8%。增殖指數(shù)：2周：對照組為30.4%,實驗組44.9%,兩者相比有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)；4周：對照組為33.7%,實驗組38.4%,兩者之間有統(tǒng)計學差異(P0.05)；8周：對照組為22.4%,實驗組26.4%,兩者之間有統(tǒng)計學差異(P0.05)。凋亡率：2周：對照組22.1%,實驗組55.1%,顯著高于對照組(P0.01)。4周：對照組0.91%,實驗組1.02%,兩者之間無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。8周：對照組0.75%,實驗組49.1%,顯著高于對照組(P0.01)。 5、LiCl干預后軟骨細胞增殖和凋亡的改變。LiCl激活β-catenin表達：8周齡正常貼壁軟骨細胞加入LiCl后免疫熒光可見胞漿以及核內β-catenin表達明顯增高,且以胞核內增多為主。干預后增殖速率(0.58)比干預前正常軟骨細胞的增殖速率(0.64)下降了9%;與8周實驗組增殖速率(0.78)相比,明顯下降約25.6%。LiCl干預后增殖指數(shù)從22.4%下降至18.5%,有統(tǒng)計學差異(P0.05)；并明顯低于8周實驗組26.4%,有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)；LiCl干預后凋亡率從0.75%上升至33.1%,有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01),但是顯著低于8周實驗組(49.1%P0.01)。 [結論] 1.新生大鼠髖關節(jié)固定十天,就可以成功制作髖脫位動物模型,在去除外固定后,髖關節(jié)不能恢復頭臼匹配關系,隨生長發(fā)育,會發(fā)生骨關節(jié)炎樣病理改變。 2.在大鼠髖脫位關節(jié)軟骨退變過程中,軟骨細胞表現(xiàn)出較強的增殖能力和過高的凋亡率。 3.β-catenin高表達對成熟軟骨細胞主要是抑制增殖而促進凋亡,可能是髖脫位發(fā)生退變的分子機制之一。
【關鍵詞】：發(fā)育性髖關節(jié)脫位 動物模型 關節(jié)軟骨 軟骨退變 骨關節(jié)炎 β-連環(huán)蛋白(β-catenin) 免疫組化染色 細胞培養(yǎng) 細胞增殖、凋亡 細胞周期 氯化鋰(LiCl) 免疫熒光
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R726.8
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-12
• 英文縮寫詞索引12-13
• 前言13-16
• 材料和方法16-24
• 一、DDH動物模型的制備及分組16
• 二、標本采集及處理16
• 三、實驗試劑以及儀器16-17
• 四、主要實驗方法和步驟17-23
• 五、實驗數(shù)據統(tǒng)計23-24
• 結果24-39
• 一、 大體形態(tài)觀察24-26
• 二、組織學觀察26-28
• 三、軟骨細胞的增殖活性和凋亡檢測28-33
• 四、LiCl干預后軟骨的增殖和闊亡改變33-39
• 討論39-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-52
• 綜述52-56
• 參考文獻54-56
• 研究生期間完成論文56-57
• 致謝57-58

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1 趙振國;王泉;王成雙;李傳郡;鄒亮;鮑同柱;;軟骨細胞增殖調控機制的研究進展[J];廣東醫(yī)學;2012年20期

2 郭平;“稀土化合物對人胚脛骨軟骨細胞增殖、分化的影響研究”課題研究進展[J];華北煤炭醫(yī)學院學報;2000年02期

3 吳劍宏,王秋根,張秋林,陸晴友,王萬宗,張素貞;胰島素樣生長因子Ⅰ對三維培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞增殖和表型的影響[J];第二軍醫(yī)大學學報;2005年04期

4 劉維統(tǒng);王躍;;中藥對軟骨細胞增殖作用的研究進展[J];中國中醫(yī)骨傷科雜志;2007年12期

5 趙U，

本文編號：629637