本文關(guān)鍵詞：乙型腦炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白篩選與鑒定

  更多相關(guān)文章： 乙型腦炎病毒 NS1蛋白 蛋白互作 酵母雙雜交 免疫共沉淀

【摘要】：乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis viruses.JEV)是黃病毒科黃病毒屬的一員,其引起的乙型腦炎是一種蚊媒性的人畜共患病,具有明顯的季節(jié)性和傳染性。人感染JEV主要造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,豬感染主要引起母豬流產(chǎn)、公豬睪丸炎和仔豬腦炎等癥狀。NS1蛋白是JEV的一個非結(jié)構(gòu)蛋白,參與病毒的復(fù)制、感染等過程。本研究以豬源JEV的NS1蛋白為誘餌蛋白,應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)從人腦組織cDNA文庫中篩選、鑒定與其發(fā)生相互作用的宿主細(xì)胞互作蛋白,本研究將對闡明NS1蛋白在JEV的增殖復(fù)制機(jī)制中的作用奠定一定的基礎(chǔ)。1、乙型腦炎病毒NS1蛋白誘餌酵母菌的構(gòu)建提取豬源JEV SCYA201201株的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,PCR擴(kuò)增NS1基因,克隆至pGBKT7載體,經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定和序列測定,成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1, JEV NS1基因大小為1245bp；將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1轉(zhuǎn)化至酵母菌Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建了JEVNS1蛋白誘餌酵母菌。運(yùn)用Western blot技術(shù)從JEV NS1蛋白誘餌酵母菌的總蛋白樣品檢測到大小約46kDa的NS1蛋白,表明NS1基因能在誘餌酵母菌中表達(dá)。對該誘餌酵母菌進(jìn)行毒性效應(yīng)和自激活效應(yīng)檢測：誘餌酵母菌與空載對照酵母菌在SD/-Trp平板上的長勢和菌落數(shù)無明顯差異,表明NS1片段的插入對誘餌酵母菌無毒性作用；誘餌酵母菌與對照酵母菌在SD/-Trp/X-α-Gal平板上長出乳白色菌落且沒有變成藍(lán)色,在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA平板上未見菌落,證明誘餌酵母菌無自激活效應(yīng)。本研究成功構(gòu)建了JEV NS1蛋白誘餌酵母菌,為進(jìn)一步篩選JEV NS1蛋白相互作用的宿主蛋白提供了研究材料。2、乙型腦炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白篩選運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)將JEV NS1蛋白誘餌酵母菌與人腦組織cDNA文庫菌進(jìn)行雜交和兩輪篩選,第一輪以SD/-Trp/-Leu/X-a-Gal/AbA營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基平板對雜交產(chǎn)物進(jìn)行篩選,獲得72個克隆子。第二輪篩選挑取藍(lán)色菌落克隆子,分別接種于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基平板,并反復(fù)進(jìn)行2次,共獲得7個陽性克隆子。進(jìn)一步對陽性克隆子利用Ampicillin抗性篩選、PCR鑒定和序列測定,獲得5個陽性單克隆子；測定序列在Genbank上進(jìn)行BLAST比對,5個陽性克隆分別對應(yīng)α2-巨球蛋白(α2M)、人神經(jīng)元性分化因子6 (NeuroD6)、DAZ associated protein 2 (DAZAP 2)、金屬蛋白酶抑制劑4 (TIMP-4)和鋅指蛋白251(ZNF 251)。對獲得的5個陽性克隆子進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),分別將5個陽性克隆子的文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建獵物酵母菌,將獵物酵母菌與誘餌酵母菌一對一組合進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證,5個獵物酵母菌均為陽性結(jié)果。本研究應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)從人腦組織cDNA文庫中成功篩選到了5種與JEVNS1蛋白相互作用的宿主蛋白。3、乙型腦炎病毒NS1蛋白與宿主互作蛋白相互作用的鑒定構(gòu)建NS1蛋白和各宿主蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒,提取豬源乙腦SCYA201201株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模版,PCR擴(kuò)增NS1基因序列克隆至pEGFP載體,經(jīng)PCR鑒定、雙酶切和測序分析,成功構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-NS1,插入片段大小為1245bp；提取人胚腎細(xì)胞(293細(xì)胞)的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,根據(jù)Gene Bank上5個宿主蛋白的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)合成引物并應(yīng)用PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因序列,克隆至pCMV-HA載體,經(jīng)PCR鑒定、雙酶切和測序分析,成功構(gòu)建各互作蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒,插入片段大小分別為α2M 741bp、NEUR0D6 1012bp、 DAZAP2504bp、TIMP-4672bp、ZNF251825bp。運(yùn)用Western blot檢測構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒在293細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示JEV NS1蛋白與3個宿主蛋白(a2M、DAZAP2、TIMP-4)能穩(wěn)定的表達(dá)。運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證NS1蛋白與3個宿主蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用,結(jié)果驗(yàn)證出蛋白DAZAP2能與NS1蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用,未能驗(yàn)證出α2M和TIMP-4與NS1蛋白在細(xì)胞中的相互作用。本研究使用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證了宿主蛋白與NS1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用,得到JEV NS1蛋白的宿主互作蛋白DAZAP2,為研究NS1蛋白在JEV的增殖復(fù)制機(jī)制中的作用奠定了一定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：乙型腦炎病毒 NS1蛋白 蛋白互作 酵母雙雜交 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞表9-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1 NS1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能13-18
• 1.1 NS1蛋白的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.2 NS1蛋白參與病毒的復(fù)制14-15
• 1.3 NS1蛋白參與病毒RNA的合成15
• 1.4 NS1蛋白與自噬作用15-16
• 1.5 NS1蛋白對病毒毒力的影響16-17
• 1.6 NS1蛋白與信號通路17
• 1.7 NS1蛋白的免疫保護(hù)性17-18
• 2 黃病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用18-19
• 2.1 NS1蛋白的宿主受體18
• 2.2 黃病毒其它蛋白的宿主細(xì)胞受體18-19
• 3 酵母雙雜交技術(shù)19-22
• 3.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理19-20
• 3.2 酵母雙雜交技術(shù)的運(yùn)用20-22
• 研究的目的與意義22-23
• 第二部分 試驗(yàn)研究23-70
• 第一章 乙型腦炎病毒NS1蛋白誘餌酵母菌的構(gòu)建23-45
• 1 試驗(yàn)材料23-25
• 1.1 菌株和載體23
• 1.2 病毒株23
• 1.3 主要試劑23-24
• 1.4 所需溶液及配制24-25
• 1.5 主要儀器設(shè)備25
• 2 試驗(yàn)方法25-37
• 2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1的構(gòu)建25-33
• 2.2 誘餌酵母菌的制備33-35
• 2.3 誘餌酵母菌表型鑒定35-37
• 3 結(jié)果與分析37-42
• 3.1 NS1基因的TA克隆鑒定37-38
• 3.2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1的PCR鑒定和酶切鑒定38-40
• 3.3 誘餌酵母菌的鑒定40
• 3.4 目標(biāo)蛋白表達(dá)的鑒定40-41
• 3.5 毒性效應(yīng)檢測41-42
• 3.6 自激活效應(yīng)檢測42
• 4 討論42-44
• 5 小結(jié)44-45
• 第二章 乙型腦炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白篩選45-55
• 1 試驗(yàn)材料45-46
• 1.1 菌株和質(zhì)粒45
• 1.2 主要試劑45
• 1.3 所需溶液及配制配制45-46
• 1.4 主要儀器設(shè)備46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-48
• 2.1 酵母雙雜交第一輪篩選46-47
• 2.2 第二輪篩選47
• 2.3 陽性克隆的鑒定47
• 2.4 回復(fù)雜交驗(yàn)證47-48
• 3 結(jié)果與分析48-51
• 3.1 交雜交率的計(jì)算48
• 3.2 篩選結(jié)果48-49
• 3.3 陽性克隆質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果49
• 3.4 陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果49-50
• 3.5 回復(fù)雜交驗(yàn)證結(jié)果50-51
• 4 討論51-54
• 5 小結(jié)54-55
• 第三章 乙型腦炎病毒NS1蛋白與宿主互作蛋白相互作用的鑒定55-70
• 1 試驗(yàn)材料55-56
• 1.1 菌株和病毒株55
• 1.2 細(xì)胞系、載體質(zhì)粒55
• 1.3 主要試劑55-56
• 1.4 所需溶液及配制56
• 1.5 主要儀器設(shè)備56
• 2 實(shí)驗(yàn)方法56-62
• 2.1 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建56-59
• 2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒檢測59-61
• 2.3 免疫共沉淀驗(yàn)證61-62
• 3 結(jié)果與分析62-67
• 3.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-NS1的PCR鑒定和酶切鑒定62-63
• 3.2 宿主蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定和酶切鑒定結(jié)果63-65
• 3.3 真核表達(dá)結(jié)果65
• 3.4 免疫共沉淀結(jié)果65-67
• 4 討論67-69
• 5 小結(jié)69-70
• 全文結(jié)論70-71
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 附錄78-81
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文81-82
• 致謝82

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：938383