本文關(guān)鍵詞：表面蛋白EF3183對致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11部分生物學(xué)特性影響的研究

  更多相關(guān)文章： 致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11 表面蛋白EF3183 同源重組 生物被膜

【摘要】：腸球菌雖然是人類和動物腸道正常菌群的重要組成部分,但在醫(yī)學(xué)臨床和獸醫(yī)臨床完全證實具有致病性。腸球菌廣泛的致病性除了與其獨特的耐藥性有關(guān)外,眾多的毒力因子也發(fā)揮著重要作用。在眾多毒力因子中其一系列的表面蛋白在細(xì)菌對宿主細(xì)胞的粘附、定殖以及致病性方面發(fā)揮著重要作用。本研究在前期工作基礎(chǔ)上,以致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11為親本株,應(yīng)用同源重組的方法構(gòu)建新篩選出的表面蛋白EF3183基因突變株,培養(yǎng)He La及RAW264.7細(xì)胞,通過觀察突變株對He La細(xì)胞的粘附能力和EF3183單抗的粘附抑制、小鼠RAW264.7細(xì)胞的侵染能力、小鼠主要臟器的載菌能力以及對BF形成能力的影響。來闡述新篩選的表面蛋白EF3183在XJ11株致病過程中的作用,為進(jìn)一步闡明糞腸球菌的致病機理提供有用數(shù)據(jù)�，F(xiàn)將試驗結(jié)果報告如下:1、致羔羊腦炎糞腸球菌表面蛋白基因的檢測:根據(jù)致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05全基因組測序的結(jié)果,設(shè)計特異性引物,采用PCR擴增檢測表面蛋白EF1092、EF1269、EF2224、EF2505、EF3183在11株致羔羊腦炎糞腸球菌中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五種表面蛋白在11株致羔羊腦炎糞腸球菌中廣泛分布,除XJ09只含有EF2224外,其余10株菌中均含有五種表面蛋白。2、致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11株EF3183基因的克隆與生物信息學(xué)分析:采用PCR方法擴增EF3183基因,將陽性克隆進(jìn)行測序,用生物信息學(xué)軟件預(yù)測期功能,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,成功獲得了長1060 bp的表面蛋白EF3183基因;經(jīng)生物信息學(xué)分析,此序列包含有一個1056 bp的完整開放閱讀框,編碼351個氨基酸;無信號肽;有2個跨膜區(qū);抗原表位預(yù)測顯示表面蛋白EF3183有15個抗原表位;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11株表面蛋白EF3183基因與糞腸球菌v583的EF3183基因的進(jìn)化距離最近。3、致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11-Δ3183突變株的構(gòu)建:應(yīng)用同源重組技術(shù)構(gòu)建XJ11的EF3183基因突變株,使用Primer 5設(shè)計引物,擴增出用于失活表面蛋白EF3183基因的插入序列,酶切、回收該基因序列,并與酶切后的穿梭質(zhì)粒進(jìn)行連接后,電轉(zhuǎn)化至E.faecalis XJ11的感受態(tài)細(xì)胞中。使用卡那霉素抗性篩選出陽性轉(zhuǎn)化子,并采用PCR等方法進(jìn)行鑒定。最終成功得到基因突變株E.faecalis XJ11-Δ3183。4、E.faecalis XJ11-Δ3183在細(xì)胞粘附、特異性單抗粘附抑制、侵染及臟器載菌量研究:以E.faecalis XJ11為對照組,E.faecalis XJ11-Δ3183為實驗組,分別于粘附He La細(xì)胞1 h和2 h后裂解細(xì)胞,在E.faecalis XJ11粘附He La細(xì)胞前加入抗表面蛋白EF3183的單克隆抗體,裂解細(xì)胞涂平板后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù);于細(xì)菌侵染小鼠RAW264.7細(xì)胞4 h和24 h后,裂解細(xì)胞,涂平板進(jìn)行細(xì)菌計數(shù);在不同時間人工感染小鼠,取肝小葉、脾臟、左腎和心臟組織勻漿,勻漿液稀釋后涂平板統(tǒng)計細(xì)菌數(shù)計算小鼠臟器載菌量。結(jié)果顯示與野毒株比較,EF3183突變株的對He La細(xì)胞粘附數(shù)量明顯下降,且差異極顯著(P0.001)。加入單抗的E.faecalis XJ11對He La細(xì)胞粘附數(shù)量明顯出現(xiàn)下降,且差異極顯著(P0.001)。侵染小鼠RAW264.7細(xì)胞細(xì)菌數(shù)量變化不明顯,且差異不顯著(P0.05)。感染小鼠6 h、12 h和24 h后,突變株在小鼠肝小葉、脾臟、左腎的載菌量下降明顯,且差異極顯著(P0.01);在心臟的載菌量下降明顯,且差異顯著(P0.05)。5、E.faecalis XJ11-Δ3183生物被膜形成能力的研究:將E.faecalis XJ11和E.faecalis XJ11-Δ3183在分別置于37℃條件下于96孔板中培養(yǎng)8 h、18 h、24 h、36 h和48 h,經(jīng)1%結(jié)晶紫染色后,測定各個孔的吸光度。同時用孔底放有蓋玻片的六孔板培養(yǎng)細(xì)菌,經(jīng)刀豆蛋白A或PI染色后,將蓋玻片取出后用激光共聚焦顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示E.faecalis XJ11所形成生物被膜的吸光度明顯高于E.faecalis XJ11-Δ3183,統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著(P0.05);野毒株生物被膜基質(zhì)中形成的多糖數(shù)量更多且結(jié)構(gòu)致密,其中包埋的細(xì)菌呈現(xiàn)區(qū)域化的分布,而E.faecalis XJ11-Δ3183在氣液交界面形成完整的生物被膜不夠完整。
【關(guān)鍵詞】：致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11 表面蛋白EF3183 同源重組 生物被膜
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 全文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮略詞表12-13
• 前言13-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-23
• 1.生態(tài)學(xué)與流行病學(xué)14
• 2.毒力因子14-17
• 2.1 聚合蛋白（AS / Agg）14-15
• 2.2 胞外表面蛋白（Esp）15
• 2.3 微生物表面成分識別粘附基質(zhì)分子（MSCRAMMs）15
• 2.4 溶細(xì)胞素（Cyl）15-16
• 2.5 透明質(zhì)酸酶（Hyl）16
• 2.6 性信息素（Sex Pheromones）16-17
• 3.耐藥特點17-19
• 3.1 β-內(nèi)酰胺類耐藥17
• 3.2 氨基糖苷類耐藥17-18
• 3.3 糖肽類耐藥18
• 3.4 利奈唑胺耐藥18
• 3.5 達(dá)托霉素耐藥18-19
• 4.生物被膜（BF）19-23
• 4.1 EPS與BF結(jié)構(gòu)19-20
• 4.2 胞外多糖20
• 4.3 胞外蛋白20-21
• 4.4 胞外DNA21
• 4.5 表面活性劑與脂類21-22
• 4.6 水22-23
• 第二章 試驗內(nèi)容23-61
• 試驗一 致羔羊腦炎糞腸球菌表面蛋白基因的檢測23-29
• 1.材料23-25
• 1.1 樣本及菌株來源23-24
• 1.2 試劑24
• 1.3 引物24
• 1.4 儀器24-25
• 1.5 主要緩沖液和試劑的配制25
• 2.方法25
• 2.1 表面蛋白基因的PCR擴增25
• 3.結(jié)果25-27
• 3.1 表面蛋白基因的PCR檢測25-27
• 4.討論27-29
• 試驗二 致羔羊腦炎糞腸球菌EF3183基因的克隆與生物信息學(xué)分析29-38
• 1. 材料29-30
• 1.1 樣本來源29-30
• 1.2 試劑30
• 2. 方法30-31
• 2.1 引物的設(shè)計與合成30
• 2.2 XJ11株羔羊腦炎糞腸球菌表面蛋白EF3183基因的PCR擴增30
• 2.3 致羔羊腦炎糞腸球菌EF3183基因的克隆及鑒定30
• 2.4 XJ11株表面蛋白EF3183基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析30-31
• 2.5 XJ11株表面蛋白EF3183基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析31
• 3. 結(jié)果31-37
• 3.1 XJ11株細(xì)菌EF3183基因的PCR擴增與鑒定31-32
• 3.2 XJ11株表面蛋白EF3183基因的生物信息學(xué)分析32-35
• 3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析35-37
• 4. 討論37-38
• 試驗三 致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11-Δ3183突變株的構(gòu)建38-45
• 1. 材料38-40
• 1.1 菌株、質(zhì)粒38
• 1.2 主要試劑38-39
• 1.3 引物設(shè)計與合成39
• 1.4 儀器39
• 1.5 主要緩沖液和試劑的配制39-40
• 2. 方法 (按吳利先方法進(jìn)行[116])40-42
• 2.1 XJ11培養(yǎng)及基因組DNA提取40
• 2.2 EF3183基因插入片段的PCR擴增及回收純化40-41
• 2.3 pTX4577-Δ3183的構(gòu)建41
• 2.4 電轉(zhuǎn)化用E. faecalis XJ11感受態(tài)細(xì)胞的制備（甘氨酸法）41
• 2.5 電轉(zhuǎn)化41-42
• 2.6 同源重組株的鑒定42
• 3. 結(jié)果42-44
• 3.1 EF3183基因插入片段PCR擴增結(jié)果42-43
• 3.2 重組質(zhì)粒pTX4577-Δ3183的雙酶切鑒定結(jié)果43
• 3.3 突變株的鑒定結(jié)果43-44
• 4. 討論44-45
• 試驗四 E. faecalis XJ11-Δ3183在細(xì)胞粘附、侵染及臟器載菌量與野毒株的對比研究45-52
• 1. 材料46-47
• 1.1 菌株和實驗動物46
• 1.2 主要試劑46
• 1.3 主要儀器46
• 1.4 主要試劑的配置46-47
• 2 方法47-48
• 2.1 HeLa細(xì)胞粘附與粘附抑制試驗47
• 2.2 RAW264.7 侵染試驗47-48
• 2.3 小鼠心、肝、脾、腎載菌量的測定48
• 3. 結(jié)果48-50
• 3.1 HeLa細(xì)胞粘附與粘附抑制試驗48-49
• 3.2 小鼠RAW264.7 細(xì)胞侵染試驗49
• 3.3 小鼠載菌量測定結(jié)果49-50
• 4. 討論50-52
• 試驗五 E. faecalis XJ11-Δ3183生物被膜形成能力的研究52-61
• 1.材料52-53
• 1.1 菌株52
• 1.2 主要試劑52-53
• 1.3 主要儀器53
• 1.4 主要試劑配置53
• 2.方法53-54
• 2.1 96孔板定量檢測法（polystyrene microtiter plate assay)檢測BF形成量53-54
• 2.2 BF形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察54
• 3.結(jié)果54-59
• 3.1 BF形成量的測定結(jié)果54-55
• 3.2 BF形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察55-59
• 4.討論59-61
• 全文結(jié)論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-72
• 致謝72-73
• 附錄73-74
• 作者簡歷74-75
• 附件75

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本文編號：921213