發(fā)布時(shí)間：2017-09-11 15:26

  本文關(guān)鍵詞：組成型表達(dá)豬抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌構(gòu)建及生物學(xué)活性分析

  更多相關(guān)文章： 豬抗菌肽PR39、PF1 干酪乳桿菌 組成型表達(dá) 生物學(xué)活性

【摘要】：抗菌肽普遍存在于生物界,除具有廣譜的抗菌活性,其對(duì)病毒、真菌、寄生蟲和原蟲以及癌細(xì)胞也有一定的抑制作用,在天然免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要作用�？咕腜R39、PF1是Cathelicidin家族的成員,富含脯氨酸。乳酸桿菌是可以定植于腸道的益生菌,它作為宿主菌表達(dá)外源蛋白具有其他原核或真核細(xì)胞不具備的優(yōu)勢(shì)。本研究以GenBank發(fā)表的豬抗菌肽PF1和PR39基因?yàn)槟０?設(shè)計(jì)一段重組基因序列,用剛性linker連接兩段抗菌肽基因,并在序列前端添加了用于檢測(cè)蛋白表達(dá)的myc蛋白標(biāo)簽,依據(jù)乳酸桿菌的密碼子偏嗜性進(jìn)行了優(yōu)化,合成了一段基因PF1-PR39。以合成基因?yàn)槟０?利用P1、P2引物擴(kuò)增基因并替換其酶切位點(diǎn)為Bam H I和Xho I,并將其克隆在p MD19-T Simple載體上。通過(guò)Bam H I和Xho I雙酶切,回收PF1-PR39目的基因片段并將其克隆到PPH-pPG612組成型表達(dá)載體上。重組獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌ATCC L.casei 393,獲得能夠組成型表達(dá)豬源抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393。以Western-blot和間接免疫熒光的方法檢測(cè)重組抗菌肽的表達(dá),并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行探索。用動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線法和瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)重組蛋白對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌、李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌的抑制活性。結(jié)果表明,重組豬抗菌肽PF1-PR39在重組菌中獲得正確表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為17.8 k Da。重組豬抗菌肽PF1-PR39對(duì)大腸埃希氏菌、巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、和銅綠假單胞菌具有一定的抗菌效果,對(duì)李斯特菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用不明顯。為檢測(cè)表達(dá)豬抗菌肽的重組菌對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用,選取4-5周齡清潔級(jí)BABL/c雌性小鼠,體重14~17g,隨機(jī)分成3組,每組15只小鼠。試驗(yàn)組小鼠每天灌服200μL 1×109 CFU重組干酪乳桿菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393菌液;空載體組灌服200μL 1×109 CFU PPH-pPG612/L393菌液;培養(yǎng)基組每天灌服200μL MRS培養(yǎng)基,連續(xù)灌服21天。在實(shí)驗(yàn)前和第7、14、21天對(duì)各組小鼠的體重進(jìn)行稱重,計(jì)算各組平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和各個(gè)時(shí)期的料重比(F/G)。在實(shí)驗(yàn)的第7、14天,分別對(duì)每組小鼠進(jìn)行尾部采血;在第21天,每組隨機(jī)選3只小鼠脫頸致死,眼球采血,取小腸腸段并刮取其腸黏液。以小腸組織提取總RNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。ELISA方法檢測(cè)各時(shí)段的血液樣本中免疫球蛋白Ig G、Ig M含量,以及腸黏液中sIg A的含量。各組余下的小鼠再平均分為2組,分別口服感染一定劑量的產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門氏菌,然后分別觀測(cè)重組菌對(duì)感染后小鼠的保護(hù)作用并檢測(cè)其排菌情況。結(jié)果表明,灌服表達(dá)豬抗菌肽PF1-PR39重組菌的小鼠平均日增重有極顯著的提高(P0.01),料重比也有顯著降低(P0.05);實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞比率與培養(yǎng)基組比較有所增加,但差異不顯著;灌服表達(dá)重組抗菌肽的小鼠血清中Ig G、Ig M濃度比其余小鼠增高,其中IgM變化顯著(P0.05),腸黏液中s Ig A含量略有提升但變化不明顯;以小鼠小腸組織RNA反轉(zhuǎn)錄后的c DNA為模板,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,PPH-pPG612-PF1-PR39/L393組小鼠TGF-β表達(dá)水平有較明顯的提高,TNF-α水平也有所提高,IFN-γ、IL-4、IL-6的表達(dá)水平下降,但有的差異并不顯著;灌服表達(dá)PF1-PR39的重組菌的小鼠對(duì)感染產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和沙門氏菌的小鼠具有一定程度的保護(hù)效應(yīng),死亡率下降,保護(hù)率分別達(dá)到83.3%和66.7%。綜上,本研究所構(gòu)建的組成型表達(dá)豬抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌在體外具有一定的抑菌活性;重組菌用來(lái)飼喂小鼠可以提高小鼠的生長(zhǎng)性能,提高了非特異性免疫的功能,對(duì)感染致病菌的小鼠有一定的保護(hù)作用,這為表達(dá)抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌可以作為微生態(tài)制劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：豬抗菌肽PR39、PF1 干酪乳桿菌 組成型表達(dá) 生物學(xué)活性
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.6
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-20
• 1.1 抗菌肽結(jié)構(gòu)與特性的研究進(jìn)展12-15
• 1.1.1 抗菌肽的來(lái)源12-13
• 1.1.2 抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征13-14
• 1.1.3 豬源抗菌肽的分類及其特性14-15
• 1.2 抗菌肽的生物學(xué)功能15-17
• 1.2.1 抗細(xì)菌的功能15-16
• 1.2.2 抗病毒和抗腫瘤的功能16
• 1.2.3 抗真菌的功能16
• 1.2.4 抗寄生蟲和原蟲的功能16
• 1.2.5 免疫調(diào)節(jié)功能16-17
• 1.3 PR39、PF1的結(jié)構(gòu)及抗菌特性和機(jī)制17-18
• 1.4 乳酸菌的益生特性和作為基因工程宿主菌的研究進(jìn)展18-19
• 1.5 研究目的與意義19-20
• 2 材料與方法20-34
• 2.1 材料20-22
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 2.1.3 引物20
• 2.1.4 抗體和主要生化試劑20-21
• 2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備21-22
• 2.2 試驗(yàn)方法22-34
• 2.2.1 豬抗菌肽PF1-PR39基因序列的獲得22-25
• 2.2.2 組成型表達(dá)豬抗菌肽PF1-PR39重組干酪乳桿菌的構(gòu)建25-28
• 2.2.3 重組干酪乳桿菌的表達(dá)與鑒定28-29
• 2.2.4 重組干酪乳桿菌體外抑菌活性檢測(cè)29-30
• 2.2.5 重組干酪乳桿菌飼喂小鼠體內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)30-33
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析33-34
• 3 結(jié)果34-47
• 3.1 豬抗菌肽PF1-PR39基因序列的獲得34-35
• 3.1.1 合成基因PF1-PR39的PCR擴(kuò)增結(jié)果34
• 3.1.2 重組質(zhì)粒pMD19-Ts-PF1-PR39的鑒定結(jié)果34-35
• 3.2 重組質(zhì)粒PPH-PPG612-PF1-PR39的鑒定結(jié)果35-36
• 3.3 重組干酪乳桿菌的構(gòu)建和鑒定36-37
• 3.4 重組干酪乳桿菌的表達(dá)鑒定37-38
• 3.4.1 重組菌表達(dá)蛋白的Western-blot檢測(cè)37
• 3.4.2 間接免疫熒光鑒定重組蛋白的表達(dá)37-38
• 3.5 重組干酪乳桿菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果38-40
• 3.5.1 動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線法測(cè)量抑菌活性38-39
• 3.5.2 瓊脂孔穴擴(kuò)散法測(cè)量抑菌活性39-40
• 3.6 重組干酪乳桿菌對(duì)小鼠生理功能的影響40-47
• 3.6.1 重組干酪乳桿菌對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響40-41
• 3.6.2 重組干酪乳桿菌對(duì)小鼠免疫學(xué)指標(biāo)和血液生理指標(biāo)的影響41-43
• 3.6.3 小鼠體內(nèi)抗致病菌感染的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-47
• 4 討論47-51
• 4.1 豬抗菌肽PF1-PR39在干酪乳桿菌中的表達(dá)47-48
• 4.2 重組干酪乳桿菌體外抑菌效果評(píng)價(jià)48
• 4.3 重組干酪乳桿菌對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響48-49
• 4.4 重組干酪乳桿菌對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用49-50
• 4.5 表達(dá)PF1-PR39的重組干酪乳桿菌作為飼料添加劑的應(yīng)用前景50-51
• 5 結(jié)論51-52
• 致謝52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 附錄60-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64

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