本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白免疫生物學(xué)功能的初步研究

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【摘要】：研究表明,輻照致弱血吸蟲疫苗能夠誘生高保護(hù)性免疫效果,其機(jī)制可能是通過輻照致弱血吸蟲來源的分子刺激宿主免疫細(xì)胞在肺部形成了以Th1為主的致炎性環(huán)境而實(shí)現(xiàn)的。因此,發(fā)現(xiàn)和鑒定這些保護(hù)性分子并闡明其免疫生物學(xué)功能,對研發(fā)高效安全的抗血吸蟲分子疫苗具有重要的指導(dǎo)意義。本文旨在研究日本血吸蟲鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白(SchistosomajaponicumCalreticulin,SjCRT)在先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中的作用和功能,以期為闡明輻照致弱血吸蟲疫苗的保護(hù)機(jī)制提供依據(jù)。1、SjCRT在不同期別正常及輻照致弱童蟲上的表達(dá)。體外培養(yǎng)不同期別的輻照和正常童蟲,用胰酶消化成單個細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)4 d時SjCRT在輻照組蟲體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量明顯高于正常組(P0.05);而7 d、10 d和14 d時,SjCRT在輻照組蟲體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量明顯低于正常組(P0.05)。RT-PCR檢測SjCRT轉(zhuǎn)錄水平變化,發(fā)現(xiàn)輻照組在7 d顯著高于正常組(P0.05),在10 d時兩組無顯著差異。初步推斷在輻照早期4 d時SjCRT在蟲體細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá),隨著體外培養(yǎng)時間推移,SjCRT釋放到細(xì)胞外。2、SjCRT活化宿主巨噬細(xì)胞的初步研究。SjCRT與RAW264.7細(xì)胞共孵育72 h,通過MTT檢測細(xì)胞增殖情況、Griess法檢測胞外NO含量、RT-PCR法檢測巨噬細(xì)胞上幾種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)、ELISA檢測胞外細(xì)胞因子、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子。MTT結(jié)果顯示,SjCRT能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖(P0.05);RT-PCR結(jié)果顯示SjCRT促進(jìn)巨噬細(xì)胞上調(diào)表達(dá)COX-2、cPLA2、CCR7、TNF-α和IL-1βmRNA;Griess法結(jié)果提示,SjCRT能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO(P0.01);ELISA結(jié)果表明SjCRT能夠極其顯著地促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α(P0.01);流式細(xì)胞術(shù)表明,未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞能表達(dá)一定水平的CCR7,但SjCRT的刺激能使巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7的表達(dá)水平極顯著地增加(P0.05)。提示SjCRT可以活化巨噬細(xì)胞。3、探究SjCRT活化宿主DC的機(jī)制。通過激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)研究SjCRT與DC的結(jié)合情況、RT-PCR檢測DC上幾種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況、ELISA檢測DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子表達(dá)情況、流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面CCR7和CXCR4表達(dá)情況、CFSE法檢測CD4+T細(xì)胞增殖、ELISA檢測CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果:SjCRT可以結(jié)合在DC表面,它能夠與DC表面的CD91受體結(jié)合進(jìn)而被介導(dǎo)內(nèi)吞;RT-PCR結(jié)果顯示與未刺激相比,SjCRT的刺激可以促進(jìn)DC極其顯著地上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、CXCL-2、CCR7和CXCR4這幾種細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA的表達(dá)(P0.01);SjCRT的刺激也能促進(jìn)DC極其顯著的表達(dá)并分泌TNF-α、IFN-γ和IL-4,并且差異極其顯著(P0.01);流式結(jié)果顯示SjCRT的刺激能使細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7和CXCR4的表達(dá)水平極顯著地增加(P0.01);CFSE法表明SjCRT刺激組有明顯的增殖現(xiàn)象,增殖細(xì)胞百分比分別為47.7%和44.1%;ELISA檢測CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子分泌情況,顯示SjCRT刺激48h后的DC能夠促進(jìn)T細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10,并且與對照組相比差異極顯著(P0.01)。結(jié)果提示:SjCRT能夠促進(jìn)DC功能成熟。4、SjCRT誘導(dǎo)致敏小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。SjCRT刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞48 h后,MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群狀況以及胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示該蛋白能夠顯著地刺激致敏小鼠淋巴細(xì)胞增殖(SI2);蛋白免疫組CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值為2.26顯著高于對照組的1.76(P0.01),且胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)量顯著增加(P0.05)。提示SjCRT可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)SjCRT在輻照童蟲早期能夠大量表達(dá)并釋放到細(xì)胞外。SjCRT可以活化巨噬細(xì)胞、通過CD91受體介導(dǎo)進(jìn)入DC促進(jìn)DC功能成熟并且能夠活化CD4+T細(xì)胞并誘導(dǎo)其向Th1型分化。為DC進(jìn)一步誘導(dǎo)抗原特異性的CD4+T細(xì)胞的分化(極化)提供了基礎(chǔ),也為為進(jìn)一步闡明SjCRT在輻照致弱血吸蟲疫苗模型中所發(fā)揮的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 日本血吸蟲鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白 樹突狀細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 CD4+T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.735
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 緒論13-18
• 1.1 血吸蟲生物學(xué)及抗血吸蟲疫苗研究概述13-14
• 1.2 樹突狀細(xì)胞(DC)功能及其作用機(jī)制概述14-16
• 1.3 鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白研究概述16-18
• 第二章 SjCRT在不同期別正常及輻照致弱尾蚴/童蟲細(xì)胞上的表達(dá)18-27
• 2.1 實(shí)驗材料18-19
• 2.1.1 實(shí)驗主要試劑及儀器18
• 2.1.2 實(shí)驗動物18
• 2.1.3 主要溶液配制18-19
• 2.2 實(shí)驗方法19-21
• 2.2.1 收集和培養(yǎng)不同期別正常及輻照致弱日本血吸蟲童蟲19
• 2.2.2 RT-PCR檢測SjCRT在各期別正常及輻照致弱童蟲轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)19-21
• 2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測SjCRT在不同期別正常及輻照蟲體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)21
• 2.3 實(shí)驗結(jié)果21-25
• 2.3.1 SjCRT在不同期別輻照及正常童蟲轉(zhuǎn)錄水平的差異比較21-22
• 2.3.2 SjCRT在不同期別正常童蟲及輻照致弱童蟲蟲體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況22-25
• 2.4 討論25-27
• 第三章 SjCRT活化宿主巨噬細(xì)胞的初步研究27-37
• 3.1 實(shí)驗材料27
• 3.1.1 細(xì)胞27
• 3.1.2 實(shí)驗主要試劑及儀器27
• 3.2 實(shí)驗方法27-29
• 3.2.1 SjCRT蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的檢測和觀察27-28
• 3.2.2 Griess法檢測SjCRT刺激巨噬細(xì)胞后NO的分泌情況28
• 3.2.3 RT-PCR法檢測巨噬細(xì)胞上幾種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)28-29
• 3.2.4 ELISA法檢測巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌情況29
• 3.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測趨化因子受體CCR7在巨噬細(xì)胞上表達(dá)29
• 3.3 實(shí)驗結(jié)果29-35
• 3.3.1 SjCRT蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的檢測和觀察29-31
• 3.3.2 SjCRT蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO31-32
• 3.3.3 SjCRT促進(jìn)巨噬細(xì)胞上調(diào)表達(dá)COX-2、cPLA2、CCR7、TNF-α 和IL-1β mRNA32-34
• 3.3.4 SjCRT誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞因子情況34
• 3.3.5 SjCRT促進(jìn)趨化因子受體CCR7在巨噬細(xì)胞上表達(dá)34-35
• 3.4 討論35-37
• 第四章 SjCRT活化DC促進(jìn)研究DC功能成熟及機(jī)制的研究37-49
• 4.1 實(shí)驗材料37-38
• 4.1.1 實(shí)驗主要試劑及儀器37
• 4.1.2 實(shí)驗動物37
• 4.1.3 實(shí)驗主要試劑配制37-38
• 4.2 實(shí)驗方法38-40
• 4.2.1 激光共聚焦觀察SjCRT結(jié)合DC的過程38-39
• 4.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC吞噬SjCRT情況39
• 4.2.3 RT-PCR檢測DC上幾種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況39
• 4.2.4 ELISA檢測DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子表達(dá)情況39
• 4.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面CCR7和CXCR4表達(dá)情況39-40
• 4.2.6 CFSE法檢測CD4+T細(xì)胞增殖40
• 4.2.7 ELISA檢測CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子分泌情況40
• 4.3 實(shí)驗結(jié)果40-47
• 4.3.1 激光共聚焦觀察SjCRT結(jié)合DC的過程40-41
• 4.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC吞噬SjCRT情況41-42
• 4.3.3 RT-PCR檢測DC上幾種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況42-44
• 4.3.4 ELISA檢測DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子表達(dá)情況44-45
• 4.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面CCR7和CXCR4表達(dá)情況45-46
• 4.3.6 CFSE法檢測CD4+T細(xì)胞增殖46-47
• 4.3.7 ELISA檢測CD4+T細(xì)胞胞外細(xì)胞因子分泌情況47
• 4.4 討論47-49
• 第五章 SjCRT誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細(xì)胞反應(yīng)的研究49-56
• 5.1 實(shí)驗材料49
• 5.1.1 實(shí)驗主要試劑及儀器49
• 5.1.2 實(shí)驗動物49
• 5.2 實(shí)驗方法49-51
• 5.2.1 MTT法檢測SjCRT致敏小鼠脾臟混合淋巴細(xì)胞增殖49-50
• 5.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測SjCRT致敏小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群50
• 5.2.3 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測50-51
• 5.2.4 ELISA法檢測脾臟混合淋巴細(xì)胞胞外細(xì)胞因子51
• 5.3 實(shí)驗結(jié)果51-54
• 5.3.1 SjCRT促進(jìn)脾臟混合淋巴細(xì)胞增殖51
• 5.3.2 SjCRT致敏小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群的測定51-53
• 5.3.3 混合淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測53
• 5.3.4 ELISA法檢測脾臟混合淋巴細(xì)胞胞外細(xì)胞因子53-54
• 5.4 討論54-56
• 第六章 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 致謝61-62
• 作者簡歷62

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馬麗貞;日本血吸蟲鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白免疫生物學(xué)功能的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

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本文編號：811986