發(fā)布時間：2017-09-07 08:31

  本文關(guān)鍵詞：牛支原體滅活疫苗的研究

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【摘要】：牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)是一種引起以牛呼吸系統(tǒng)病為主的重要病原微生物,給國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,國內(nèi)外對牛支原體疫苗的研究還不夠成熟,本文在病原分離鑒定以及純化的基礎(chǔ)上建立了M.bovis家兔感染模型,優(yōu)化了M.bovis的滅活條件,成功制備出了M.bovis滅活疫苗,通過動物實驗分析了不同免疫劑量和不同免疫途徑對免疫效果的影響,對不同佐劑進行對比,找到合適的免疫佐劑,驗證免疫效果。具體研究方法如下：1.將不同濃度梯度的M. bovis分離株以滴鼻的方式感染到家兔呼吸系統(tǒng),通過比較感染前后家兔的臨床、剖檢各組織病理變化等以判斷是否成功感染,從感染后家兔肺臟、血液中分離出支原體,將培養(yǎng)物純化后進行PCR檢測,進一步親緣關(guān)系分析和血清抗體檢測。結(jié)果顯示：1.0×108ccu/ml的M. bo vis就可使家兔致病,1.0×1010ccu/ml的M.bovis感染到家兔呼吸道之后家兔表現(xiàn)出精神抑郁；剖檢后病變主要表現(xiàn)在肺臟,出現(xiàn)水腫、大理石病變等,部分還出現(xiàn)胸腔積液；從肺臟病變組織切片可見肺泡腔出血,肺泡間隙增寬、細支氣管上皮黏膜壞死和脫落；用特異性PCR和基因測序的方法對感染后家兔體內(nèi)分離到的病原進行鑒定,同時檢測感染家兔血清中是否出現(xiàn)M.bovis抗體,最終證實M. bovis在家兔體內(nèi)感染成功。2.用終濃度為0.3%、0.4%、0.5%的甲醛分別對M.bovis培養(yǎng)物進行滅活。為驗證滅活效果,將滅活的M.bovis培養(yǎng)物培養(yǎng)并將培養(yǎng)物人工感染實驗動物,比較M. bovis培養(yǎng)物免疫前后的免疫原性。結(jié)果顯示：終濃度為0.5%的甲醛短期內(nèi)就能將M.bovis徹底滅活,但其免疫原性大大降低,不利于滅活疫苗的制備,終濃度為0.3%的甲醛處理60h后只能將M. bovis部分滅活,終濃度為0.4%的甲醛滅活48h后能將支原體徹底滅活,免疫原性略微降低不影響免疫效果,為最佳滅活條件。3.先將M.bovis液體培養(yǎng)物用終濃度為0.4%的甲醛滅活,其次以用O.lmol/L的PBS洗滌后分別與白油、氫氧化鋁、弗氏完全佐劑混合得到5.0×109ccu/ml的M. bovis滅活疫苗,將洗滌后的培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋后得到1.0×1010ccu/ml的滅活疫苗,對疫苗穩(wěn)定性和無菌性進行檢測,最終證實疫苗安全可靠,可以使用。4.將自制的M.bovis滅活疫苗以不同劑量,不同的免疫途徑,添加不同佐劑對家兔進行免疫。免疫后通過觀察家兔臨床表現(xiàn)和注射部位的變化來評價疫苗的安全性,通過監(jiān)測家兔體內(nèi)免疫球蛋白(IgG、IgM)、細胞因子IL-4和干擾素IFN-γ、血清抗體水平的變化來篩選最佳的免疫劑量、途徑以及合適的佐劑。結(jié)果顯示：2ml1.0×1010ccu/ml的滅活苗具有很好的保護效果；肌注后免疫效果最佳：將白油佐劑與滅活的M.bovis培養(yǎng)物1：1混合后免疫效果較氫氧化鋁和弗氏完全佐劑強。5.為了驗證自制M. bovis滅活疫苗的免疫效果。用M.bovis滅活疫苗對家兔免疫后用不同來源的M.bovis培養(yǎng)物進行攻毒,通過對實驗家兔進行病理分析,結(jié)果顯示試驗中的滅活疫苗不但對同源支原體具有一定的免疫性,同時也能夠阻止異源支原體的再次入侵。
【關(guān)鍵詞】：牛支原體 免疫 滅活疫苗 家兔 感染模型
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文獻綜述9-17
• 1 病原學(xué)9-10
• 1.1 牛支原體形態(tài)結(jié)構(gòu)9
• 1.2 牛支原體染色特性9-10
• 1.3 牛支原體培養(yǎng)特性10
• 1.4 牛支原體抵抗力10
• 2 流行病學(xué)10-11
• 2.1 牛支原體病的流行特點10-11
• 2.2 牛支原體發(fā)病的主要因素11
• 3 牛支原體致病性11-12
• 4 診斷方法12-13
• 5 免疫原性13
• 6 防治研究進展13-14
• 6.1 預(yù)防及其疫苗13-14
• 6.2 治療及其藥物篩選14
• 7 幾種主要的畜禽支原體病14-17
• 第二章 試驗研究17-47
• 試驗一 牛支原體家兔感染模型的研究17-24
• 1 材料和方法17-18
• 2 結(jié)果18-22
• 3 討論22-23
• 4 小結(jié)23-24
• 試驗二 牛支原體滅活條件研究24-29
• 1 材料與方法24-25
• 2 結(jié)果25-27
• 3 討論27-28
• 4 小結(jié)28-29
• 試驗三 牛支原體滅活苗的制備29-31
• 1 材料與方法29-30
• 2 結(jié)果30
• 3 討論30-31
• 試驗四 免疫條件的研究31-43
• 4.1 免疫劑量的研究31-34
• 1 材料與方法31
• 2 結(jié)果31-34
• 4.2 免疫途徑研究34-37
• 1 材料與方法34-35
• 2 結(jié)果35-37
• 4.3 免疫佐劑對免疫效果的影響37-40
• 1 材料與方法37
• 2 結(jié)果37-40
• 4.4 討論40-42
• 4.5 小結(jié)42-43
• 試驗五 免疫保護試驗43-47
• 1 材料與方法43
• 2 結(jié)果43-46
• 3 討論46
• 4 小結(jié)46-47
• 第三章 結(jié)論與展望47-49
• 1 全文結(jié)論47
• 2 創(chuàng)新與展望47-49
• 參考文獻49-55
• 致謝55-57
• 作者簡介57

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本文編號：808489