本文關(guān)鍵詞：表達H5亞型禽流感病毒血凝素的重組火雞皰疹病毒構(gòu)建及其免疫效力試驗

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【摘要】：H5亞型高致病性禽流感(／vian Influenza, AI)是由A型流感病毒引起禽類的一種急性、高度接觸性傳染病。H5亞型禽流感病毒的HA基因變異頻繁,目前已鑒定出很多分支。近年來,在我國流行的毒株主要集中于Clade2.3.2.1、Clade7.2 和 Clade2.3.4.4分支,因此迫切需要研制與目前流行毒株抗原性相一致的新型疫苗用于H5亞型禽流感的防控�；蛑亟M活載體疫苗因其可以有效的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答而被廣泛關(guān)注。火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)是一種具有廣闊應(yīng)用前景的病毒載體,由于HVT可以凍干保存、使用方便、對雞無致病性和不影響其生產(chǎn)性能等優(yōu)點而作為載體被廣泛應(yīng)用于重組病毒的構(gòu)建。本研究利用同源重組原理,以火雞皰疹病毒(HVT) FC126疫苗毒株為載體,以其復(fù)制非必需區(qū)US2為插入位點,構(gòu)建含EGFP表達盒的轉(zhuǎn)移載體pFR-EGF P,將轉(zhuǎn)移載體pFR-EGFP和HVT基因組共轉(zhuǎn)染CEF,經(jīng)同源重組獲得表達EGFP標(biāo)記基因的重組病毒rHVT-EGFP。本研究選擇三株分別位于Clade2.3.2.1、Clade7.2和Clade2.3.44分支的H5亞型AIV,選擇人巨細(xì)胞病毒早期啟動子(CMV),構(gòu)建包含HA基因的轉(zhuǎn)移載體pFR-HA-R6、 pFR-HA-R7、pFR-HA-R8。將轉(zhuǎn)移載體與重組病毒rHVT-EGFP的基因組共轉(zhuǎn)染CEF,經(jīng)同源重組,用HA基因表達盒替換US2區(qū)標(biāo)記基因EGFP,最終獲得表達HA基因的重組病毒rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8。重組病毒經(jīng)PCR和Western-blot試驗鑒定,結(jié)果表明,三株重組病毒的基因組中均已正確插入HA基因并能夠表達HA蛋白。對重組病毒在CEF上的生長特性進行檢測,結(jié)果顯示,重組病毒與HVT FC126疫苗毒株具有相同的復(fù)制水平。本研究評價了重組病毒(rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8)針對相應(yīng)Clade分支H5亞型AIV的免疫保護效果。將200只1日齡SPF雞隨機分成8組。依次為：rHVT-HA-R6組、rHVT-HA-R7組、rHVT-HA-R8組、禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗組、Re-6攻毒對照組、Re-7攻毒對照組、Re-8攻毒對照組和空白對照組,禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗組60只SPF雞,其余各組均20只。前三組于1日齡時,經(jīng)頸部皮下接種5000空斑形成單位(PFU)的相應(yīng)疫苗,滅活疫苗組于14日齡時,肌肉注射0.25 mL/羽禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗組。分別于7、14、21、28日齡時通過血凝抑制試驗(HI)檢測H5亞型AIV的抗體效價。除空白對照組外,其余各組于28日齡經(jīng)滴鼻點眼途徑攻毒,rHVT-HA-R6免疫組、Re-6攻毒對照組、從禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗組取20只SPF雞用HJ-14株AIV進行攻毒,rHVT-HA-R7免疫組、從禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗組取20只SPF雞用JA-14株AIV進行攻毒,rHVT-HA-R8免疫組、Re-8攻毒對照組、從禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗組取20只SPF雞用YZ-14株AIV進行攻毒,攻毒劑量均為105EID50。攻毒后繼續(xù)觀察7天,統(tǒng)計各試驗組臨床癥狀、發(fā)病率、死亡率、抗體消長及排毒規(guī)律。結(jié)果表明,在整個試驗期內(nèi),三個重組疫苗免疫組試驗雞的抗體水平呈持續(xù)上升的趨勢,而攻毒對照組在攻毒之前均未檢測到抗體。在H5亞型AIV強毒株攻毒之后,與對照組相比,三個重組疫苗免疫組試驗雞的抗體水平迅速上升。rHVT-HA-R6、 rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8免疫組的攻毒保護率均為100%,所有結(jié)果均表明重組病毒對與H5亞型AIV抗原性相一致的強毒株攻擊可以提供完全的免疫保護。
【關(guān)鍵詞】：禽流感病毒 火雞皰疹病毒 HA基因 同源重組 免疫效力
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 符號說明11-13
• 第一章 火雞皰疹病毒的研究進展13-19
• 1 HVT的分子生物學(xué)特性13-14
• 2 HVT作為載體的研究進展14-16
• 3 重組病毒的構(gòu)建方法16
• 4 影響構(gòu)建重組HVT的主要因素16-17
• 4.1 插入位點的選擇16-17
• 4.2 表達外源基因的啟動子選擇17
• 5 禽流感重組疫苗的研究進展17-19
• 第二章 表達H5亞型禽流感病毒血凝素的重組火雞皰疹病毒構(gòu)建及其免疫效力試驗19-48
• 1 材料19-21
• 1.1 雞胚及試驗動物19
• 1.2 毒株、菌株和質(zhì)粒19-20
• 1.3 主要試劑20
• 1.3.1 主要化學(xué)試劑20
• 1.3.2 分子生物學(xué)試劑20
• 1.4 分子生物學(xué)軟件20-21
• 1.5 主要儀器21
• 2 方法21-34
• 2.1 轉(zhuǎn)移載體pFR的構(gòu)建21-25
• 2.1.1 同源臂引物的設(shè)計21
• 2.1.2 HVT基因組的獲取21-22
• 2.1.3 目的片段的克隆與測序22-23
• 2.1.4 轉(zhuǎn)移載體p-FR的構(gòu)建23-24
• 2.1.5 轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定24-25
• 2.2 真核表達載體pT-cmv-HA的構(gòu)建25-27
• 2.2.1 引物設(shè)計25
• 2.2.2 病毒的擴增25
• 2.2.3 病毒RNA的提取25
• 2.2.4 RT-PCR25-26
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物連接與陽性克隆的鑒定26
• 2.2.6 克隆載體pT-cmv-HA的構(gòu)建26-27
• 2.3 轉(zhuǎn)移載體pFR-EGFP和pFR-HA的構(gòu)建27-28
• 2.4 轉(zhuǎn)移載體的鑒定表達28-29
• 2.4.1 載體pFR-EGFP的鑒定28
• 2.4.2 載體pFR-HA-R6、pFR-HA-R7、pFR-HA-8的鑒定28-29
• 2.5 表達綠色熒光蛋白的重組火雞皰疹病毒構(gòu)建29-30
• 2.5.1 HVT基因組的提取29
• 2.5.2 表達綠色熒光蛋白(EGFP)的重組病毒拯救29-30
• 2.5.3 重組病毒rHVT-EGFP的純化30
• 2.6 表達H5亞型AIV HA基因重組HVT的構(gòu)建30-31
• 2.7 重組病毒的鑒定31-32
• 2.7.1 PCR鑒定31
• 2.7.2 Western-Blot試驗鑒定31-32
• 2.7.3 間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定32
• 2.7.4 重組病毒在CEF生長特性的檢測32
• 2.8 重組病毒對H5亞型AIV的免疫保護評價32-34
• 2.8.1 動物試驗設(shè)計32-33
• 2.8.2 臨床癥狀及剖檢病變的觀察33
• 2.8.3 排毒檢測33-34
• 3. 結(jié)果34-46
• 3.1 轉(zhuǎn)移載體pFR的構(gòu)建34-35
• 3.1.1 同源臂的克隆及鑒定34
• 3.1.2 轉(zhuǎn)移載體pFR的構(gòu)建與酶切鑒定34-35
• 3.2 轉(zhuǎn)移載體pFR-EGFP的構(gòu)建與酶切鑒定35
• 3.3 轉(zhuǎn)移載體pFR-EGFP的表達鑒定35-36
• 3.4 重組病毒rHVT-EGFP的構(gòu)建36
• 3.5 真核表達載體pFR-HA-R6、pFR-HA-R7、pFR-HA-R8的構(gòu)建36-37
• 3.5.1 HA基因的克隆36-37
• 3.5.2 HA基因表達盒的擴增37
• 3.6 轉(zhuǎn)移載體pFR-HA-R6、pFR-HA-R7、pFR-HA-R8的鑒定37-38
• 3.6.1 酶切鑒定38
• 3.6.2 Western-Blot試驗鑒定38
• 3.7 重組病毒rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8的構(gòu)建38-39
• 3.8 重組病毒rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8的鑒定39-43
• 3.8.1 PCR鑒定39-40
• 3.8.2 間接免疫熒光試驗40-41
• 3.8.3 Western-Blot試驗41-42
• 3.8.4 重組病毒在CEF上的生長曲線42-43
• 3.9 重組病毒的免疫效力評價43-46
• 3.9.1 HI抗體消長規(guī)律43-44
• 3.9.2 攻毒后排毒率44-45
• 3.9.3 發(fā)病率和死亡率45-46
• 4. 討論46-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻49-54
• 附錄54-57
• 致謝57-58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 賈偉新;廖明;;從活禽交易的干預(yù)效果看我國禽流感的流行與防控[J];中國家禽;2015年22期

2 蔣文明;陳繼明;;我國高致病性禽流感的流行與防控[J];中國動物檢疫;2015年06期

3 趙冬鳳;高軒;劉新文;胡瀟;李明義;;表達H5N1亞型禽流感HA-NA基因重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建[J];中國動物檢疫;2008年04期

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本文編號：799545