本文關(guān)鍵詞：P38MAPK和GCR在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞GnRH表達中的作用

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【摘要】：糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)是一種類固醇激素,其濃度受到下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenocoyical axis,HPA)軸的調(diào)控,在維持機體的穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)生殖及免疫等功能中發(fā)揮了重要作用。促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-relesaing horme,GnRH)是一種10肽激素,是繁殖活動最重要的調(diào)節(jié)激素,主要通過下丘腦-垂體-性腺(Hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)軸來對生殖活動進行調(diào)控。在應(yīng)激情況下,HPA軸主要通過分泌GC影響HPG軸,從而影響生殖,母畜的生殖能力會通過此種方式而下降。星形膠質(zhì)細胞在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位,尤其在生殖、免疫、應(yīng)激等方面。根據(jù)本實驗室已完成的工作中,已經(jīng)在體外證明了星形膠質(zhì)細胞能夠分泌GnRH,然而其受到哪種信號通路的調(diào)節(jié)仍然未知。GC-GCR是糖皮質(zhì)激素發(fā)揮經(jīng)典基因組效應(yīng)的系統(tǒng),P38 MAPK是與免疫相關(guān)的最重要信號通路。但其兩者在星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH中發(fā)揮怎樣的作用,未有相關(guān)資料報道。因此,在應(yīng)激情況下星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH會發(fā)生怎樣的變化,星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH會受到怎樣的調(diào)節(jié)成為了本實驗的研究重點。本實驗利用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細胞,探究P38 MAPK和GCR在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的GnRH表達中的作用,其中主要研究內(nèi)容如下:(1)不同濃度GC對星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響;(2)GCR在GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH中的作用;(3)P38 MAPK信號通路對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響;(4)P38 MAPK下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響。(1)為了有效的探究P38 MAPK和GCR在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的GnRH表達中的作用,本實驗采用1~3日齡的雌性SD新生大鼠,培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞,經(jīng)過原代培養(yǎng)、純化和傳代培養(yǎng),獲得所需細胞,經(jīng)星形膠質(zhì)細胞特異性標記蛋白-膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色檢驗細胞,所得細胞的純化率達99%以上,可進行后續(xù)實驗。(2)為了研究不同濃度gc對星形膠質(zhì)細胞分泌gnrh的影響,以糖皮質(zhì)激素類似物地塞米松(dex)刺激星形膠質(zhì)細胞,用10-4mol/l、10-5mol/l、10-6mol/l、10-7mol/l、10-8mol/l的dex分別處理1h、12h、24h、48h后,利用elisa檢測不同濃度gc對星形膠質(zhì)細胞gnrh的分泌情況、利用實時熒光定量pcr檢測gnrh的mrna轉(zhuǎn)錄水平,并利用westernblot檢測在各濃度gc處理下gcr的變化情況,結(jié)果顯示,1h、12h、24h、48h時10-4mol/l、10-5mol/l、10-6mol/l、10-7mol/l、10-8mol/lgc處理組的蛋白及mrna轉(zhuǎn)錄水平均在不同階段顯著高于對照組(p0.05),gcr在各時間段中對10-8mol/l濃度的gc最為敏感,綜合分析確定10-8mol/l的gc為最佳的實驗處理濃度。(3)為了研究gcr在gc刺激星形膠質(zhì)細胞分泌gnrh中的作用,通過使用10-8mol/ldex-bsa與dex分別刺激星形膠質(zhì)細胞,分別設(shè)置gc-bsa組、gc組和對照組,用免疫熒光方法檢測gcr的激活情況,并利用elisa和實時熒光定量pcr方法對各組gnrh分泌量和mrna轉(zhuǎn)錄水平的變化進行檢測,結(jié)果顯示,gc組在1h、24h轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組(p0.05),12h、24h的蛋白水平顯著高于對照組證明(p0.05),而gc-bsa組在各時間段與對照組相比無顯著性差異,證明當gcr激活后能夠促進糖皮質(zhì)激素刺激星形膠質(zhì)細胞gnrh的分泌。(4)為了研究p38mapk信號通路是否對gc刺激星形膠質(zhì)細胞分泌gnrh具有調(diào)節(jié)作用,通過使用10μmol/l的p38阻斷劑sb203580及10-8mol/ldex處理,分別設(shè)置p38阻斷劑組、p38阻斷劑+gc組、gc組與對照組,分別處理1h、12h、24h、48h后,檢測各組gnrh分泌量、mrna水平的變化及gcr激活情況,結(jié)果顯示在12h、24h時p38阻斷劑+gc組與gc組的蛋白及轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對照組(p0.05),且p38阻斷劑+gc組在mrna轉(zhuǎn)錄水平顯著高于gc組(p0.05),而在48h時p38阻斷劑+gc組仍保持較高的分泌水平顯著高于對照組(p0.05),而p38阻斷劑組的蛋白與轉(zhuǎn)錄水平在各時間段與對照組無顯著性差異,綜上所述表明,在gcr激活后,阻斷p38mapk信號通路對gc刺激星形膠質(zhì)細胞分泌gnrh具有上調(diào)作用。(5)為了研究p38mapk對激活下游核轉(zhuǎn)錄因子nf-κb的影響,通過使用10μmol/l的p38阻斷劑sb203580及10-8mol/ldex處理,分別設(shè)置p38阻斷劑組、p38阻斷劑+gc組、gc組與對照組,分別處理1h、12h、24h、48h后,并通過westernblot檢測不同時間nf-κb(p65)磷酸化情況。結(jié)果顯示1h、12h時gc處理組的磷酸化p65表達量極顯著高于對照組(p0.01),24h時顯著高于對照組(p0.05);1h、12h時p38阻斷劑組、p38阻斷劑+gc組的磷酸化p65表達量極顯著低于對照組(P0.01),24 h時、P38阻斷劑+GC組顯著低于對照組(P0.05);1 h、12 h時P38阻斷劑組與P38阻斷劑+GC組的磷酸化P65表達量無顯著差異(P0.05)。證明經(jīng)GC處理后的星形膠質(zhì)細胞的磷酸化P65表達量會增加,在加入P38阻斷劑后的星形膠質(zhì)細胞磷酸化P65表達量會降低,并且該過程不會受到GC的刺激而增加。綜上可知,P38 MAPK是引起核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB磷酸化的關(guān)鍵激酶。(6)為了研究P38 MAPK信號通路下游的NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子是否對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH具有調(diào)節(jié)作用,通過使用10μmol/L NF-κB阻斷劑BAY11-7082及10-8 mol/L DEX處理,分別設(shè)置NF-κB阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+GC組、GC組與對照組,分別處理1 h、12 h、24 h、48 h后,檢測各組GnRH分泌量、mRNA水平的變化及GCR信號通路激活情況,結(jié)果顯示在12 h、24 h時NF-κB阻斷劑+GC組、GC組的蛋白水平顯著高于對照組(P0.05),而NF-κB阻斷劑+GC組在1 h、12 h、24 h、48 h極顯著高于對照組與GC組(P0.01)結(jié)果證明,在GCR激活后阻斷P38 MAPK信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH具有上調(diào)作用。綜上所述,該試驗可以得到以下結(jié)果:1、糖皮質(zhì)激素在10-8 mol/L至10-4 mol/L濃度范圍內(nèi),均能促進星形膠質(zhì)細胞中分泌GnRH,且糖皮質(zhì)激素濃度越高這種促進分泌作用時間越長。2、糖皮質(zhì)激素能夠通過激活GCR促進星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH。3、當GCR激活后,阻斷P38 MAPK-NF-κB信號通路及對糖皮質(zhì)激素刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH具有上調(diào)作用,即P38 MAPK-NF-κB信號通路對GCR在星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的過程中具有抑制作用。4、GCR在糖皮質(zhì)激素促進星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH中起到主導作用。
【關(guān)鍵詞】：糖皮質(zhì)激素 星形膠質(zhì)細胞 P38 MAPK NF-κB
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 英文縮略說明7-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 第一章 文獻綜述14-22
• 1.1 糖皮質(zhì)激素的作用機制研究進展14-15
• 1.1.1 糖皮質(zhì)激素發(fā)揮功能的經(jīng)典信號通路14
• 1.1.2 糖皮質(zhì)激素的抗炎機理及其作用14-15
• 1.1.3 糖皮質(zhì)激素抑制生殖中的機理15
• 1.2 星形膠質(zhì)細胞的重要生理功能研究進展15-17
• 1.2.1 星形膠質(zhì)細胞在損傷應(yīng)激中的作用16
• 1.2.2 星形膠質(zhì)細胞在血腦屏障中的作用16-17
• 1.3 促性腺激素釋放激素及其受體研究進展17-19
• 1.3.1 GnRH在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的生理學功能17-18
• 1.3.2 GnRH受體在機體的分布情況18-19
• 1.4 P38 MAPK信號通路與糖皮質(zhì)激素受體（GCR）的關(guān)系19-22
• 1.4.1 P38 MAPK通路在炎癥中的調(diào)節(jié)機制19
• 1.4.2 糖皮質(zhì)激素受體經(jīng)典通路與P38 MAPK通路的相互作用19-22
• 第二章 引言22-24
• 第三章 實驗材料及方法24-38
• 3.1 試驗材料24-28
• 3.1.1 試驗動物24
• 3.1.2 主要試劑24-25
• 3.1.3 實驗儀器25-26
• 3.1.4 試劑配制26-28
• 3.2 實驗方法28-38
• 3.2.1 星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)28-29
• 3.2.2 星形膠質(zhì)細胞的純度鑒定29-30
• 3.2.3 不同濃度GC對星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響30-33
• 3.2.4 GCR在GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH中的作用33-34
• 3.2.5 P38 MAPK信號通路對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響34-35
• 3.2.6 P38 MAPK下游NF-κB對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響35-38
• 第四章 結(jié)果與分析38-58
• 4.1 星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)38-39
• 4.1.1 星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)38-39
• 4.1.2 星形膠質(zhì)細胞傳代培養(yǎng)39
• 4.2 星形膠質(zhì)細胞的純度鑒定39-40
• 4.3 不同濃度GC對星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響40-46
• 4.3.1 ELISA檢測不同濃度GC對星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響40-42
• 4.3.2 RT-PCR檢測不同濃度GC對星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄GnRH mRNA的影響42-44
• 4.3.3 Western Blot檢測不同濃度GC對星形膠質(zhì)細胞的GCR的影響44-46
• 4.4 GCR在GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH中的作用46-49
• 4.4.1 免疫熒光觀察星形膠質(zhì)細胞GCR的激活現(xiàn)象46-48
• 4.4.2 ELISA研究GCR激活后對星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響48
• 4.4.3 RT-PCR研究GCR激活后對星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄GnRH mRNA的影響48-49
• 4.5 P38 MAPK信號通路對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響49-54
• 4.5.1 ELISA研究P38 MAPK對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響49-50
• 4.5.2 RT-PCR研究P38 MAPK對GC刺激星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄GnRH mRNA的影響50-51
• 4.5.3 免疫熒光研究P38 MAPK阻斷后對激活GCR的影響51-53
• 4.5.4 通過Western Blot研究P38 MAPK對激活下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的影響53-54
• 4.6 P38 下游 NF-κB 對 GC 刺激星形膠質(zhì)細胞分泌 Gn RH 的影響54-58
• 4.6.1 ELISA研究NF-κB對GC刺激星形膠質(zhì)細胞分泌GnRH的影響54-55
• 4.6.2 RT-PCR研究NF-κB對GC刺激星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄GnRH mRNA的影響55-56
• 4.6.3 免疫熒光研究NF-κB對激活星形膠質(zhì)細胞GCR的影響56-58
• 第五章 分析與討論58-62
• 5.1 關(guān)于GC最佳濃度的探討58
• 5.2 關(guān)于GCR向細胞核匯聚現(xiàn)象的探討58-59
• 5.3 P38 MAPK信號通路與GC對星形膠質(zhì)細胞的作用的關(guān)系59
• 5.4 NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子與GC對星形膠質(zhì)細胞的作用的關(guān)系59-60
• 5.5 選題對生產(chǎn)實踐的作用60-62
• 第六章 結(jié)論62-64
• 參考文獻64-72
• 致謝72-74
• 在讀期間發(fā)表的文章74

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