本文關(guān)鍵詞：硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體的制備、表征及其體外抗金黃色葡萄球菌生物膜的研究

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【摘要】：硫酸頭孢喹肟為第四代動物用頭孢類抗生素,因其對絕大部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較強(qiáng)的殺滅效果而常用于治療由金黃色葡萄球菌等細(xì)菌引起的家畜呼吸道疾病以及乳房炎疾病等。有研究表明,金黃色葡萄球菌較易形成生物膜,這也是該細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因之一。所以尋找抗金黃色葡萄球菌生物膜的新型有效制劑對該菌的防控有著至關(guān)重要的意義。本研究旨在構(gòu)建硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體并探討其對細(xì)菌生物膜的作用,以獲得對金黃色葡萄球菌具有較好作用的硫酸頭孢喹肟新制劑。通過優(yōu)化硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體的制備工藝,并對其相關(guān)性質(zhì)、體外釋放以及抗金黃色葡萄球菌生物膜的效果進(jìn)行考察,達(dá)到了預(yù)期研究目的。主要研究結(jié)果如下：1.建立了專屬性較強(qiáng)的反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定硫酸頭孢喹肟的體外含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=51313C-22439,R2=0.9997,藥物濃度在1.25～160 μg/ml之間與峰面積有較好的線性關(guān)系,回收率99.30%-101.60%,日間和日內(nèi)精密度均小于5%,該方法可用于藥物含量測定并排除雜質(zhì)和輔料的干擾。同時,對脂質(zhì)體破乳劑及低溫高速離心法分離脂質(zhì)體與游離藥物的效果進(jìn)行了考察,結(jié)果表明,加入適量的四氫呋喃可以充分破壞脂質(zhì)體的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)：將脂質(zhì)體溶液4℃,15000 r/min,離心1 h可以將游離藥物與脂質(zhì)體良好分離,且游離藥物的回收率達(dá)到99.72%-101.17%,為后期制劑工藝的設(shè)計和優(yōu)化打下基礎(chǔ)。2.采用固體分散法結(jié)合泡騰水化法制備硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體,以包封率為主要考察指標(biāo)并結(jié)合制劑外觀形態(tài),設(shè)計單因素實驗以及正交實驗對硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體的制備方法進(jìn)行篩選,得到最佳處方工藝為：減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為54℃,CC14的用量為20 ml, Tween80用量為75μ1,大豆卵磷脂與膽固醇的用量比為2：1,藥物與大豆卵磷脂和膽固醇的用量比為1：10,檸檬酸與NaHCO3的用量比為5：1,藥物與十八胺的用量比為1：5。此工藝下得到的脂質(zhì)體平均包封率為63.21%,載藥量為4.04%。3.按最佳工藝處方制備得到的硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體分散后為白色均勻混懸液,其平均粒徑為201.5 nm, Zeta電位為65.29 mV。體外累積釋放實驗顯示,8 h時,原料藥的累計釋放量達(dá)到了藥物總量的97.82%,陽離子脂質(zhì)體僅達(dá)到了藥物總量的73.94%,這證明本試驗制備得到的陽離子脂質(zhì)體具有定的緩釋性。溶血性試驗和刺激性試驗結(jié)果表明所制備脂質(zhì)體無明顯溶血效果和血管刺激性。藥物穩(wěn)定性試驗證明硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體在高濕度和強(qiáng)光照射下不穩(wěn)定,應(yīng)干燥避光保存。4.采用二倍稀釋法考察硫酸頭孢喹肟溶液、硫酸頭孢喹肟普通脂質(zhì)體及其陽離子脂質(zhì)體對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌及10株豬源性臨床分離菌的最小抑菌濃度(MIC值)。結(jié)果顯示,三種制劑對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌的MIC值依次分別為1、1.34、0.48 μg/ml,三種制劑對臨床菌的MIC值均有不同程度的上升,說明臨床菌有一定的耐藥性,硫酸頭孢喹肟陽離子脂質(zhì)體對部分臨床菌的MIC值小于溶液。通過分光光度計法檢測了硫酸頭孢喹肟溶液及其陽離子脂質(zhì)體對金黃色葡萄球菌生長曲線的抑制作用,結(jié)果顯示,在加入藥物2h后,細(xì)菌的生長曲線開始出現(xiàn)差距；而同樣為0.5MIC藥物濃度,陽離子脂質(zhì)體抑制細(xì)菌生長的效果更明顯。藥物濃度≥MIC值時,藥物作用后的金黃色葡萄球菌生長很快進(jìn)入衰亡期,藥物濃度越高,進(jìn)入衰亡期的時間越快,甚至跳過了細(xì)菌生長的對數(shù)期及穩(wěn)定期。5.運(yùn)用剛果紅、結(jié)晶紫、硝酸銀等方法共同鑒定了金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌及10株豬源性臨床菌生物膜的形成能力。MTT法測定了藥物對金黃色葡萄球菌生物膜的清除率及藥物作用時間對金黃色葡萄球菌生物膜的清除效果。結(jié)果顯示,11株金黃色葡萄球菌均能形成穩(wěn)定的生物膜結(jié)構(gòu),其中4株細(xì)菌形成細(xì)菌生物膜的能力較強(qiáng)。同樣為MIC藥物濃度條件下,陽離子脂質(zhì)體在24 h對細(xì)菌生物膜的清除效果更明顯。而2.5MIC值時,其對生物膜的清除率已經(jīng)達(dá)到了81.30%。同時藥物濃度與細(xì)菌生物膜的清除率呈正相關(guān),且藥物對細(xì)菌生物膜的清除能力表現(xiàn)出了時間依賴性。環(huán)境掃描電鏡圖像結(jié)果表明,本試驗所制得脂質(zhì)體與生物膜接觸后,其中的細(xì)菌數(shù)量及生物膜基質(zhì)的量均有所降低,這些結(jié)果均證實陽離子脂質(zhì)體制劑在抗金黃色葡萄球菌生物膜方面有一定優(yōu)勢。本課題研究結(jié)果表明,采用固體分散法結(jié)合泡騰水化法制備得到的硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體方法簡便,質(zhì)量可控,重現(xiàn)性好,包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)均符合脂質(zhì)體制劑要求。該制劑能夠減緩體外金黃色葡萄球菌的生長速度,同時對該菌所形成的生物膜有一定的清除效果,為硫酸頭孢喹肟新制劑的研發(fā)和細(xì)菌生物膜的防控提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：硫酸頭孢喹肟 陽離子前體脂質(zhì)體 金黃色葡萄球菌 生物膜 體外
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S859.796
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述及立題依據(jù)14-25
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-23
• 1 金黃色葡萄球菌生物膜的研究概述14-17
• 2 頭孢喹肟的研究概況17-19
• 2.1 頭孢喹肟的理化性質(zhì)17-18
• 2.2 頭孢喹肟的藥效學(xué)研究18-19
• 2.3 頭孢喹肟的制劑研究19
• 3 脂質(zhì)體對細(xì)菌生物膜控制的潛在應(yīng)用19-23
• 3.1 脂質(zhì)體的特點19-20
• 3.2 前體脂質(zhì)體的概述20-22
• 3.3 脂質(zhì)體在細(xì)菌生物膜上的應(yīng)用22-23
• 第二章 立題背景及目的意義23-25
• 第二部分 試驗研究25-72
• 第一章 硫酸頭孢喹肟含量測定方法的建立25-33
• 1 材料和方法25-28
• 1.1 試驗材料25-26
• 1.2 試驗方法26-28
• 2 結(jié)果和分析28-31
• 2.1 測定波長的選擇28
• 2.2 方法專屬性考察結(jié)果28-29
• 2.3 硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立29-30
• 2.4 加樣回收率和方法回收率試驗結(jié)果30-31
• 2.5 破乳劑的選擇31
• 2.6 游離藥物回收率的測定結(jié)果31
• 3 討論與小結(jié)31-33
• 第二章 硫酸頭孢喹肟陽離子前體脂質(zhì)體的制備工藝及處方研究33-41
• 1 材料和方法33-35
• 1.1 試驗材料33
• 1.2 試驗方法33-35
• 2 結(jié)果和分析35-39
• 2.1 單因素試驗結(jié)果35-38
• 2.2 正交試驗優(yōu)化工藝結(jié)果38-39
• 2.3 最佳工藝驗證39
• 3 討論和小結(jié)39-41
• 第三章 硫酸頭孢喹肟陽離子脂質(zhì)體的性能評價41-51
• 1 材料和方法41-44
• 1.1 試驗材料41
• 1.2 試驗方法41-44
• 2 結(jié)果和分析44-49
• 2.1 制劑的外觀形態(tài)記錄結(jié)果44
• 2.2 環(huán)境掃描電子顯微鏡記錄結(jié)果44-45
• 2.3 制劑粒徑大小、分布及Zeta電位的測定結(jié)果45
• 2.4 脂質(zhì)體包封率及其載藥量的測定45-46
• 2.5 藥物體外累積釋放考察46-47
• 2.6 溶血性試驗47-48
• 2.7 家兔刺激性試驗48
• 2.8 藥物穩(wěn)定性試驗48-49
• 3 討論與小結(jié)49-51
• 第四章 硫酸頭孢喹肟陽離子脂質(zhì)體體外抗金黃色葡萄球菌的研究51-57
• 1 材料和方法51-53
• 1.1 試驗材料51-52
• 1.2 試驗方法52-53
• 2 結(jié)果和分析53-55
• 2.1 藥物抗S.aureus的MIC結(jié)果53-54
• 2.2. 不同濃度藥物對S.aureus標(biāo)準(zhǔn)菌生長的抑制作用結(jié)果54-55
• 3 討論與小結(jié)55-57
• 第五章 硫酸頭孢喹肟陽離子脂質(zhì)體對金黃色葡萄球菌生物膜的影響57-69
• 1 材料和方法57-60
• 1.1 試驗材料57
• 1.2 試驗方法57-60
• 2 結(jié)果和分析60-66
• 2.1 剛果紅實驗鑒定結(jié)果60
• 2.2 結(jié)晶紫染色結(jié)果60-61
• 2.3 硝酸銀染色結(jié)果61
• 2.4 11株S.aureus生物膜形成能力的篩選結(jié)果61-62
• 2.5 藥物抗S.aureus生物膜的活性結(jié)果62-64
• 2.6 藥物作用時間不同對S.aureus標(biāo)準(zhǔn)菌生物膜的清除率64-65
• 2.7 藥物對S.aureus生物膜的清除圖像觀察結(jié)果65-66
• 3 討論與小結(jié)66-69
• 第六章 結(jié)論與創(chuàng)新69-72
• 1 結(jié)論69-71
• 2 創(chuàng)新71-72
• 參考文獻(xiàn)72-81
• 致謝81-82
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄82

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