本文關鍵詞：藍氏賈第蟲賈第素α-13及延伸因子EF-1α的原核表達及亞細胞定位

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【摘要】：藍氏賈第蟲是一種重要的人獸共患寄生性原蟲,寄生于人和多種哺乳動物的小腸,常引起以腹瀉、腹痛和消化不良等為主的賈第蟲病。賈第蟲滋養(yǎng)體具有高度發(fā)達的細胞骨架系統(tǒng)(微管、微絲和骨架蛋白),在入侵宿主過程中能夠釋放一些分泌性蛋白,兩者均與其致病機理密切相關。本文以人獸共患的藍氏賈第蟲A型為研究對象,分別擴增賈第素α-13和延伸因子EF-1α的編碼基因并進行原核表達,利用Ni-NTA Resin層析柱對表達產物進行純化,分別制備多克隆抗體對賈第素α-13及EF-1α進行滋養(yǎng)體的亞細胞定位,以便為探索賈第素α-13及EF-1α的生物學功能奠定基礎。1.賈第素α-13的原核表達及亞細胞定位。根據GenBank中賈第素α-13基因序列設計引物,以賈第蟲DNA基因組為模板,擴增賈第素α-13基因。構建重組表達質粒pET-28a(+)-g-α13并轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。采用IPTG誘導和復合自動誘導培養(yǎng)基(ZYM-5052)對目的蛋白進行誘導表達。表達產物經SDS-PAGE和Western blot分析鑒定并經Ni-NTA Resin層析柱純化,純化產物與免疫佐劑乳化后免疫昆明鼠制備多克隆抗體。通過Western blot篩選特異性抗血清,采用間接免疫熒光法對賈第素α-13進行亞細胞定位。結果顯示,賈第素α-13基因全長為1038 bp,編碼345個氨基酸,融合蛋白Mr約為40 kDa,主要以可溶性形式存在。試驗獲得了大量高純度的融合蛋白。制備的多克隆抗體具有良好的抗原結合力及特異性,間接免疫熒光顯示賈第素α-13主要位于滋養(yǎng)體的鞭毛和細胞膜。2.延伸因子EF-1α的原核表達及亞細胞定位。根據GenBank中EF-1α基因序列設計引物,以賈第蟲DNA為模板,擴增EF-1α基因。構建重組表達質粒pET-28a(+)-EF-1α并轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。采用IPTG對目的蛋白進行誘導表達,表達產物經SDS-PAGE和Western blot分析鑒定,并采用Ni-NTA Resin層析柱純化。經生物信息學分析后合成EF-1α抗原肽,與匙孔血藍蛋白(KLH)偶聯后免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體,采用Protein A Resin親和層析純化抗體,通過Western blot驗證抗體結合力,最后采用間接免疫熒光法對EF-1α進行亞細胞定位。結果顯示,EF-1α基因全長為1329 bp,編碼442個氨基酸,融合蛋白Mr約為50 kDa,試驗獲得了較純凈的融合蛋白;抗體AFL1192具有良好的抗原結合力與特異性,間接免疫熒光顯示EF-1α主要定位于滋養(yǎng)體兩細胞核周圍的胞漿中。
【關鍵詞】：藍氏賈第蟲 賈第素α-13 延伸因子EF-1α 原核表達 亞細胞定位
【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮寫詞與英漢對照7-13
• 1 前言13-17
• 2 材料與方法17-48
• 2.1 材料17-27
• 2.1.1 樣品17
• 2.1.2 實驗動物17
• 2.1.3 菌種17
• 2.1.4 載體17
• 2.1.5 酶和試劑17-19
• 2.1.6 主要儀器19-20
• 2.1.7 常用溶液的配制20-26
• 2.1.8 引物26-27
• 2.2 方法27-48
• 2.2.1 賈第素 α-13 的原核表達及亞細胞定位27-43
• 2.2.1.1 賈第蟲滋養(yǎng)體的培養(yǎng)及凍存27-28
• 2.2.1.2 賈第蟲基因組DNA的提取28-29
• 2.2.1.3 賈第蟲賈第素 α-13 基因的擴增29
• 2.2.1.4 PCR產物檢測29-30
• 2.2.1.5 PCR擴增產物的回收與純化30
• 2.2.1.6 p MD-18T-α-13 克隆載體的構建30-31
• 2.2.1.7 克隆載體的轉化31
• 2.2.1.8 p MD18-α-13 克隆載體的提取31-32
• 2.2.1.9 賈第素 α-13 的生物信息學分析32-33
• 2.2.1.10 帶粘性末端目的基因片段的制備33-34
• 2.2.1.11 表達載體p ET-28a(+)的線性化34
• 2.2.1.12 重組表達載體p ET-28a( + )-g-α13 的連接34-35
• 2.2.1.13 重組表達載體的轉化35
• 2.2.1.14 重組質粒的雙酶切鑒定35-36
• 2.2.1.15 重組質粒的誘導表達36-37
• 2.2.1.16 賈第素 α-13 融合蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳37-38
• 2.2.1.17 融合蛋白表達部位的檢測38
• 2.2.1.18 融合蛋白的純化38-39
• 2.2.1.19 重組蛋白Western blot檢測39
• 2.2.1.20 融合蛋白的蛋白濃度測定39-40
• 2.2.1.21 實驗動物免疫40-41
• 2.2.1.22 血清分離41
• 2.2.1.23 間接ELISA法檢測抗血清效價41
• 2.2.1.24 賈第蟲滋養(yǎng)體蟲體蛋白的提取41-42
• 2.2.1.25 Western blot檢測抗血清的結合力和特異性42
• 2.2.1.26 賈第素 α-13 的免疫熒光顯微鏡觀察42-43
• 2.2.2 賈第蟲EF-1α 蛋白的原核表達及亞細胞定位43-48
• 2.2.2.1 賈第蟲蟲株的培養(yǎng)及凍存43
• 2.2.2.2 賈第蟲基因組DNA的提取43
• 2.2.2.3 賈第蟲EF-1α 基因的擴增43-44
• 2.2.2.4 PCR產物檢測44
• 2.2.2.5 PCR擴增產物的回收與純化44
• 2.2.2.6 p MD-18T-EF-1α 克隆載體的構建44
• 2.2.2.7 克隆載體的轉化44
• 2.2.2.8 p MD18-EF-1α 克隆載體的提取44
• 2.2.2.9 賈第素EF-1α 的生物信息學分析44
• 2.2.2.10 帶粘性末端目的基因片段的制備44
• 2.2.2.11 表達載體p ET-28a(+)的線性化44
• 2.2.2.12 重組表達載體p ET-28a( + )-EF-1α 的連接44
• 2.2.2.13 重組表達載體的轉化44
• 2.2.2.14 重組質粒的雙酶切鑒定44
• 2.2.2.15 重組質粒的誘導表達44-45
• 2.2.2.16 延伸因子EF-1α 融合蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳45
• 2.2.2.17 融合蛋白表達部位的檢測45
• 2.2.2.18 融合蛋白的純化45
• 2.2.2.19 重組蛋白Western blot檢測45-46
• 2.2.2.20 融合蛋白的蛋白濃度測定46
• 2.2.2.21 延伸因子EF-1α 抗原肽的合成及偶聯46
• 2.2.2.22 實驗動物免疫46-47
• 2.2.2.23 血清分離47
• 2.2.2.24 多克隆抗體的純化47
• 2.2.2.25 間接ELISA法檢測抗血清效價47-48
• 2.2.2.26 Western blot檢測抗血清的結合力和特異性48
• 2.2.2.27 滋養(yǎng)體EF-1α 的免疫熒光顯微鏡觀察48
• 3 結果48-64
• 3.1 賈第素 α-13 的原核表達及亞細胞定位48-56
• 3.1.1 賈第素 α-13 基因的擴增與p MD18-T-α-13 克隆載體的構建48-49
• 3.1.2 重組質粒雙酶切鑒定49
• 3.1.3 賈第素 α-13 的生物信息學分析49-51
• 3.1.3.1 賈第素 α-13 的信號肽預測49
• 3.1.3.2 賈第素 α-13 的跨膜區(qū)分析49
• 3.1.3.3 賈第素 α-13 的蛋白疏水性分析49-50
• 3.1.3.4 賈第素 α-13 的磷酸化位點分析50
• 3.1.3.5 賈第素 α-13 的二級結構預測50
• 3.1.3.6 賈第素 α-13 的三級結構預測50-51
• 3.1.4 賈第素 α-13 融合蛋白表達條件的優(yōu)化51-53
• 3.1.4.1 常規(guī)IPTG的誘導表達及條件優(yōu)化51-52
• 3.1.4.2 復合自動誘導培養(yǎng)基ZYM-5052 的誘導表達52-53
• 3.1.5 重組蛋白表達部位的鑒定53
• 3.1.6 賈第素 α-13 融合蛋白的分離與純化53-54
• 3.1.7 抗血清效價測定54
• 3.1.8 賈第素 α-13 抗血清的結合力和特異性驗證54-55
• 3.1.9 賈第蟲滋養(yǎng)體 α-13 的免疫熒光定位55-56
• 3.2 延伸因子EF-1α 的原核表達及亞細胞定位56-64
• 3.2.1 賈第素 α-13 基因的擴增與p MD18-T-EF-1α 克隆載體的構建56
• 3.2.2 重組質粒的雙酶切鑒定56-57
• 3.2.3 延伸因子EF-1α 的生物信息學分析57-59
• 3.2.3.1 延伸因子EF-1α 跨膜區(qū)分析57
• 3.2.3.2 延伸因子EF-1α 蛋白疏水性分析57
• 3.2.3.3 延伸因子EF-1α 的磷酸化位點分析57
• 3.2.3.4 賈第蟲延伸因子EF-1α 蛋白二級結構預測57
• 3.2.3.5 賈第蟲延伸因子EF-1α 蛋白三級結構預測57-58
• 3.2.3.6 賈第蟲延伸因子EF-1α 的抗原表位分析58-59
• 3.2.4 賈第蟲EF-1α 蛋白的誘導表達與鑒定59-61
• 3.2.5 賈第蟲EF-1α 融合蛋白的純化及濃度測定61
• 3.2.6 賈第蟲EF-1α 蛋白特異性抗血清效價測定61
• 3.2.7 賈第蟲EF-1α 蛋白特異性抗血清的SDS-PAGE分析61-62
• 3.2.8 EF-1α 抗血清的結合力和特異性驗證62-63
• 3.2.9 賈第蟲滋養(yǎng)體EF-1α 的免疫熒光定位63-64
• 4 討論64-69
• 4.1 賈第素 α-13 的原核表達及亞細胞定位64-66
• 4.2 延伸因子EF-1α 的原核表達及亞細胞定位66-69
• 全文總結69-70
• 致謝70-71
• 參考文獻71-76
• 附錄A 賈第素α-13 及延伸因子EF-1α 擴增序列76-77
• 附錄B pMD18-T載體77-78
• 附錄C pET-28a(+)載體78-79
• 附錄D 攻讀碩士學位期間論文發(fā)表、學術會議及獲獎情況79-80

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前8條

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本文編號：743320