發(fā)布時(shí)間：2017-08-26 23:45

  本文關(guān)鍵詞：藍(lán)氏賈第蟲(chóng)賈第素α-13及延伸因子EF-1α的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位

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【摘要】：藍(lán)氏賈第蟲(chóng)是一種重要的人獸共患寄生性原蟲(chóng),寄生于人和多種哺乳動(dòng)物的小腸,常引起以腹瀉、腹痛和消化不良等為主的賈第蟲(chóng)病。賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體具有高度發(fā)達(dá)的細(xì)胞骨架系統(tǒng)(微管、微絲和骨架蛋白),在入侵宿主過(guò)程中能夠釋放一些分泌性蛋白,兩者均與其致病機(jī)理密切相關(guān)。本文以人獸共患的藍(lán)氏賈第蟲(chóng)A型為研究對(duì)象,分別擴(kuò)增賈第素α-13和延伸因子EF-1α的編碼基因并進(jìn)行原核表達(dá),利用Ni-NTA Resin層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,分別制備多克隆抗體對(duì)賈第素α-13及EF-1α進(jìn)行滋養(yǎng)體的亞細(xì)胞定位,以便為探索賈第素α-13及EF-1α的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。1.賈第素α-13的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位。根據(jù)GenBank中賈第素α-13基因序列設(shè)計(jì)引物,以賈第蟲(chóng)DNA基因組為模板,擴(kuò)增賈第素α-13基因。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-g-α13并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。采用IPTG誘導(dǎo)和復(fù)合自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(ZYM-5052)對(duì)目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析鑒定并經(jīng)Ni-NTA Resin層析柱純化,純化產(chǎn)物與免疫佐劑乳化后免疫昆明鼠制備多克隆抗體。通過(guò)Western blot篩選特異性抗血清,采用間接免疫熒光法對(duì)賈第素α-13進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,賈第素α-13基因全長(zhǎng)為1038 bp,編碼345個(gè)氨基酸,融合蛋白Mr約為40 kDa,主要以可溶性形式存在。試驗(yàn)獲得了大量高純度的融合蛋白。制備的多克隆抗體具有良好的抗原結(jié)合力及特異性,間接免疫熒光顯示賈第素α-13主要位于滋養(yǎng)體的鞭毛和細(xì)胞膜。2.延伸因子EF-1α的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位。根據(jù)GenBank中EF-1α基因序列設(shè)計(jì)引物,以賈第蟲(chóng)DNA為模板,擴(kuò)增EF-1α基因。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-EF-1α并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。采用IPTG對(duì)目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析鑒定,并采用Ni-NTA Resin層析柱純化。經(jīng)生物信息學(xué)分析后合成EF-1α抗原肽,與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體,采用Protein A Resin親和層析純化抗體,通過(guò)Western blot驗(yàn)證抗體結(jié)合力,最后采用間接免疫熒光法對(duì)EF-1α進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,EF-1α基因全長(zhǎng)為1329 bp,編碼442個(gè)氨基酸,融合蛋白Mr約為50 kDa,試驗(yàn)獲得了較純凈的融合蛋白;抗體AFL1192具有良好的抗原結(jié)合力與特異性,間接免疫熒光顯示EF-1α主要定位于滋養(yǎng)體兩細(xì)胞核周圍的胞漿中。
【關(guān)鍵詞】：藍(lán)氏賈第蟲(chóng) 賈第素α-13 延伸因子EF-1α 原核表達(dá) 亞細(xì)胞定位
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮寫詞與英漢對(duì)照7-13
• 1 前言13-17
• 2 材料與方法17-48
• 2.1 材料17-27
• 2.1.1 樣品17
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.1.3 菌種17
• 2.1.4 載體17
• 2.1.5 酶和試劑17-19
• 2.1.6 主要儀器19-20
• 2.1.7 常用溶液的配制20-26
• 2.1.8 引物26-27
• 2.2 方法27-48
• 2.2.1 賈第素 α-13 的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位27-43
• 2.2.1.1 賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體的培養(yǎng)及凍存27-28
• 2.2.1.2 賈第蟲(chóng)基因組DNA的提取28-29
• 2.2.1.3 賈第蟲(chóng)賈第素 α-13 基因的擴(kuò)增29
• 2.2.1.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)29-30
• 2.2.1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化30
• 2.2.1.6 p MD-18T-α-13 克隆載體的構(gòu)建30-31
• 2.2.1.7 克隆載體的轉(zhuǎn)化31
• 2.2.1.8 p MD18-α-13 克隆載體的提取31-32
• 2.2.1.9 賈第素 α-13 的生物信息學(xué)分析32-33
• 2.2.1.10 帶粘性末端目的基因片段的制備33-34
• 2.2.1.11 表達(dá)載體p ET-28a(+)的線性化34
• 2.2.1.12 重組表達(dá)載體p ET-28a( + )-g-α13 的連接34-35
• 2.2.1.13 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化35
• 2.2.1.14 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定35-36
• 2.2.1.15 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)36-37
• 2.2.1.16 賈第素 α-13 融合蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳37-38
• 2.2.1.17 融合蛋白表達(dá)部位的檢測(cè)38
• 2.2.1.18 融合蛋白的純化38-39
• 2.2.1.19 重組蛋白Western blot檢測(cè)39
• 2.2.1.20 融合蛋白的蛋白濃度測(cè)定39-40
• 2.2.1.21 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫40-41
• 2.2.1.22 血清分離41
• 2.2.1.23 間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)41
• 2.2.1.24 賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體蟲(chóng)體蛋白的提取41-42
• 2.2.1.25 Western blot檢測(cè)抗血清的結(jié)合力和特異性42
• 2.2.1.26 賈第素 α-13 的免疫熒光顯微鏡觀察42-43
• 2.2.2 賈第蟲(chóng)EF-1α 蛋白的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位43-48
• 2.2.2.1 賈第蟲(chóng)蟲(chóng)株的培養(yǎng)及凍存43
• 2.2.2.2 賈第蟲(chóng)基因組DNA的提取43
• 2.2.2.3 賈第蟲(chóng)EF-1α 基因的擴(kuò)增43-44
• 2.2.2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)44
• 2.2.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化44
• 2.2.2.6 p MD-18T-EF-1α 克隆載體的構(gòu)建44
• 2.2.2.7 克隆載體的轉(zhuǎn)化44
• 2.2.2.8 p MD18-EF-1α 克隆載體的提取44
• 2.2.2.9 賈第素EF-1α 的生物信息學(xué)分析44
• 2.2.2.10 帶粘性末端目的基因片段的制備44
• 2.2.2.11 表達(dá)載體p ET-28a(+)的線性化44
• 2.2.2.12 重組表達(dá)載體p ET-28a( + )-EF-1α 的連接44
• 2.2.2.13 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化44
• 2.2.2.14 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定44
• 2.2.2.15 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)44-45
• 2.2.2.16 延伸因子EF-1α 融合蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳45
• 2.2.2.17 融合蛋白表達(dá)部位的檢測(cè)45
• 2.2.2.18 融合蛋白的純化45
• 2.2.2.19 重組蛋白Western blot檢測(cè)45-46
• 2.2.2.20 融合蛋白的蛋白濃度測(cè)定46
• 2.2.2.21 延伸因子EF-1α 抗原肽的合成及偶聯(lián)46
• 2.2.2.22 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫46-47
• 2.2.2.23 血清分離47
• 2.2.2.24 多克隆抗體的純化47
• 2.2.2.25 間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)47-48
• 2.2.2.26 Western blot檢測(cè)抗血清的結(jié)合力和特異性48
• 2.2.2.27 滋養(yǎng)體EF-1α 的免疫熒光顯微鏡觀察48
• 3 結(jié)果48-64
• 3.1 賈第素 α-13 的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位48-56
• 3.1.1 賈第素 α-13 基因的擴(kuò)增與p MD18-T-α-13 克隆載體的構(gòu)建48-49
• 3.1.2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定49
• 3.1.3 賈第素 α-13 的生物信息學(xué)分析49-51
• 3.1.3.1 賈第素 α-13 的信號(hào)肽預(yù)測(cè)49
• 3.1.3.2 賈第素 α-13 的跨膜區(qū)分析49
• 3.1.3.3 賈第素 α-13 的蛋白疏水性分析49-50
• 3.1.3.4 賈第素 α-13 的磷酸化位點(diǎn)分析50
• 3.1.3.5 賈第素 α-13 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)50
• 3.1.3.6 賈第素 α-13 的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)50-51
• 3.1.4 賈第素 α-13 融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化51-53
• 3.1.4.1 常規(guī)IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化51-52
• 3.1.4.2 復(fù)合自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM-5052 的誘導(dǎo)表達(dá)52-53
• 3.1.5 重組蛋白表達(dá)部位的鑒定53
• 3.1.6 賈第素 α-13 融合蛋白的分離與純化53-54
• 3.1.7 抗血清效價(jià)測(cè)定54
• 3.1.8 賈第素 α-13 抗血清的結(jié)合力和特異性驗(yàn)證54-55
• 3.1.9 賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體 α-13 的免疫熒光定位55-56
• 3.2 延伸因子EF-1α 的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位56-64
• 3.2.1 賈第素 α-13 基因的擴(kuò)增與p MD18-T-EF-1α 克隆載體的構(gòu)建56
• 3.2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定56-57
• 3.2.3 延伸因子EF-1α 的生物信息學(xué)分析57-59
• 3.2.3.1 延伸因子EF-1α 跨膜區(qū)分析57
• 3.2.3.2 延伸因子EF-1α 蛋白疏水性分析57
• 3.2.3.3 延伸因子EF-1α 的磷酸化位點(diǎn)分析57
• 3.2.3.4 賈第蟲(chóng)延伸因子EF-1α 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)57
• 3.2.3.5 賈第蟲(chóng)延伸因子EF-1α 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)57-58
• 3.2.3.6 賈第蟲(chóng)延伸因子EF-1α 的抗原表位分析58-59
• 3.2.4 賈第蟲(chóng)EF-1α 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定59-61
• 3.2.5 賈第蟲(chóng)EF-1α 融合蛋白的純化及濃度測(cè)定61
• 3.2.6 賈第蟲(chóng)EF-1α 蛋白特異性抗血清效價(jià)測(cè)定61
• 3.2.7 賈第蟲(chóng)EF-1α 蛋白特異性抗血清的SDS-PAGE分析61-62
• 3.2.8 EF-1α 抗血清的結(jié)合力和特異性驗(yàn)證62-63
• 3.2.9 賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體EF-1α 的免疫熒光定位63-64
• 4 討論64-69
• 4.1 賈第素 α-13 的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位64-66
• 4.2 延伸因子EF-1α 的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位66-69
• 全文總結(jié)69-70
• 致謝70-71
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 附錄A 賈第素α-13 及延伸因子EF-1α 擴(kuò)增序列76-77
• 附錄B pMD18-T載體77-78
• 附錄C pET-28a(+)載體78-79
• 附錄D 攻讀碩士學(xué)位期間論文發(fā)表、學(xué)術(shù)會(huì)議及獲獎(jiǎng)情況79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 余新剛;胡偉;李國(guó)清;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)潛在致病機(jī)制初探[J];國(guó)際醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)病雜志;2015年02期

2 岑雙慶;李有全;李亞瓊;李安巖;何海寧;劉志杰;陳澤;楊吉飛;關(guān)貴全;牛慶麗;劉愛(ài)紅;任巧云;羅建勛;殷宏;;環(huán)形泰勒蟲(chóng)微線體-棒狀體蛋白的亞細(xì)胞定位分析[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2014年08期

3 余源;李巍偉;陳陽(yáng);王洋;趙麗娜;沈海娥;田喜鳳;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)細(xì)胞骨架蛋白的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2013年12期

4 王洋;王沂;楊文思;李冀;余源;沈海娥;劉青;田喜鳳;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)α-4賈第素特異性多克隆抗體的制備及免疫電鏡定位研究[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2012年12期

5 田玉娜;田喜鳳;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2010年07期

6 沈?qū)毭?譚新球;譚周進(jìn);劉勇;;影響工程菌株目的基因表達(dá)的因素[J];生物技術(shù)通報(bào);2010年03期

7 彭樹(shù)英;呂寧;賈淑玲;孫健紅;張涌;;應(yīng)用自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)體系提高原核表達(dá)效率[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2009年01期

8 周冰;曹誠(chéng);劉傳暄;;翻譯延伸因子1A的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2007年02期

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本文編號(hào)：743320