本文關鍵詞：奶牛乳房炎酵母樣真菌的分離鑒定與熒光定量PCR檢測方法的建立

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【摘要】：奶牛真菌性乳房炎常因誤診耽誤正確的治療而變成頑固性乳房炎。為調查南寧市某牛場奶牛乳房炎酵母樣真菌的感染情況以及主要病原真菌種類,本試驗采集該牛場乳樣198份,經體細胞計數(shù)檢測,結合奶牛產奶量,臨床表現(xiàn),乳樣外觀等,檢測到臨床型乳房炎乳樣92份(46.46%),隱性乳房炎乳樣17份(8.58%),對這些乳樣進行酵母樣真菌的分離鑒定,其中有51份乳樣中分離到酵母樣真菌。經假菌絲及酵母樣真菌生化管鑒定,查看TH 15-C酵母樣真菌生化鑒定編碼冊,鑒定結果如下：37份乳樣中分離到白色念珠菌(72.54%),6份乳樣中分離到砝碼念珠菌(11.76%),6份乳樣中分離到奧么畢赤酵母菌(11.76%),2份乳樣中分離到膠粘紅酵母菌(3.94%)。隨機選取21株臨床分離酵母樣真菌菌株,用4種抗真菌藥敏紙片和4種抗生素藥敏紙片對其進行藥敏試驗,結果它們均對制霉菌素有較高的敏感性,大部分菌株對兩性霉素B、酮康唑中度敏感,幾乎全部菌株對氟康唑以及丁胺卡那、頭孢曲松、慶大霉素、鏈霉素耐藥。本試驗結果為南寧市該牛場乳房炎酵母樣真菌感染的治療提供了用藥參考,且為此類乳房炎的綜合防治提供了理論基礎。奶牛真菌性乳房炎會給奶牛乳房組織造成不同程度的、不可逆轉的病理性損傷,甚至導致奶牛被淘汰或死亡。其中白色念珠菌是引起奶牛真菌性乳房炎的最主要致病菌之一。臨床上仍然使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測白色念珠菌,該方法耗時較長,可能會延誤治療而導致動物病情加重。故有必要建立一種可以快速準確診斷奶牛乳房炎白色念珠菌的方法。本研究依據(jù)白色念珠菌的ITS 2序列設計了一對引物,建立了可以快速診斷白色念珠菌的SYBR Green-I熒光定量PCR方法。本試驗所得白色念珠菌熒光定量PCR反應的標準曲線方程為：y=-3.448x+39.72,其線性系數(shù)R2=1.00,其擴增效率為95%,可檢測白色念珠菌質粒的最低濃度為1.03×101拷貝/uL。通過融解曲線分析確定該反應白色念珠菌的Tm值為87.25℃-88.25℃。使用本試驗建立的SYBR Green-I熒光定量PCR反應分別對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,無乳鏈球菌等多種乳房炎致病菌進行擴增,均無融解曲線產生,證明該反應的特異性良好。重復性試驗結果,五個濃度標準品的批內變異系數(shù)分別為0.90%,0.39%,0.34%,0.13%,0.12%,批間變異系數(shù)分別為0.21%,0.26%,0.37%,0.13%,0.19%,均在5%以下,證明該反應的重復性良好。對40份臨床乳樣進行檢測,以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為標準,本試驗建立的白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR方法的敏感性、特異性、符合率分別為100%,90.91%,96.77%。以普通PCR方法為標準,本試驗建立的SYBR Green-I熒光定量PCR方法的敏感性、特異性、符合率分別為90.32%,100%,93.02%。以上結果表明,本試驗建立的奶牛乳房炎白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性、敏感性、重復性。本試驗為奶牛乳房炎白色念珠菌的早期快速定量診斷提供了科學依據(jù),但若要將其應用于臨床診斷還需進行大量實踐研究。
【關鍵詞】：乳房炎 藥敏試驗 白色念珠菌 熒光定量PCR
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 英文縮略詞表15-16
• 第一章 緒論16-33
• 1.1 奶牛酵母樣真菌性乳房炎16-20
• 1.1.1 奶牛酵母樣真菌性乳房炎概述16-17
• 1.1.2 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的病因17-18
• 1.1.3 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的臨床特征18
• 1.1.4 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的流行病學調查18-19
• 1.1.5 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的診斷19-20
• 1.1.6 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的防治20
• 1.2 白色念珠菌20-25
• 1.2.1 白色念珠菌的生物學特性20-21
• 1.2.2 白色念珠菌診斷方法概述21-25
• 1.3 實時熒光定量PCR(qPCR)技術25-31
• 1.3.1 熒光定量PCR技術的原理25-26
• 1.3.2 熒光定量PCR技術的分類26-28
• 1.3.3 熒光定量PCR技術的定量方法28-29
• 1.3.4 融解曲線分析29-30
• 1.3.5 熒光定量PCR技術在獸醫(yī)學中的應用30-31
• 1.4 本研究的目的和意義31-33
• 第二章 南寧市某奶牛場奶牛乳房炎酵母樣真菌的分離鑒定及藥敏試驗33-43
• 2.1 試驗材料33-34
• 2.1.1 試驗試劑33
• 2.1.2 試驗設備33-34
• 2.1.3 主要試劑的配制34
• 2.2 試驗方法34-36
• 2.2.1 乳樣的來源34
• 2.2.2 乳樣的采集34-35
• 2.2.3 乳樣的分裝35
• 2.2.4 乳樣的SCC檢測35
• 2.2.5 乳樣酵母樣真菌的分離35
• 2.2.6 乳樣酵母樣真菌的鑒定35
• 2.2.7 菌種的保存35-36
• 2.2.8 臨床分離酵母樣真菌菌株的藥敏試驗36
• 2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析36
• 2.3 結果36-40
• 2.3.1 乳樣SCC檢測結果36-37
• 2.3.2 乳樣中酵母樣真菌分離結果37-38
• 2.3.3 乳樣中酵母樣真菌鑒定結果38-40
• 2.3.4 臨床分離酵母樣真菌菌株藥敏試驗結果40
• 2.4 討論40-43
• 第三章 奶牛乳房炎白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR技術檢測方法的建立與應用43-64
• 3.1 材料43-46
• 3.1.1 試驗菌株43
• 3.1.2 試驗試劑43-44
• 3.1.3 試驗設備44
• 3.1.4 試驗試劑配方44-46
• 3.2 試驗方法46-51
• 3.2.1 白色念珠菌標準菌株的活化46
• 3.2.2 菌株DNA模板的提取46
• 3.2.3 引物的設計46-47
• 3.2.4 普通PCR反應體系的建立47
• 3.2.5 普通PCR產物的鑒定47
• 3.2.6 普通PCR產物膠回收47-48
• 3.2.7 pEasy-T1載體連接和轉化48-49
• 3.2.8 質粒的提取49
• 3.2.9 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應標準品的制備、標準曲線的制作及融解曲線的建立49-50
• 3.2.10 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法的特異性試驗50
• 3.2.11 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法的敏感性試驗50
• 3.2.12 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法的重復性試驗50-51
• 3.2.13 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法臨床樣品檢測的初步應用51
• 3.2.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析51
• 3.3 結果51-60
• 3.3.1 白色念珠菌PCR反應退火溫度優(yōu)化結果51-52
• 3.3.2 PCR擴增產物的驗證52-53
• 3.3.3 重組質粒PCR鑒定結果53-54
• 3.3.4 白色念珠菌部分核酸序列重組質粒測序結果54
• 3.3.5 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應的標準曲線54-55
• 3.3.6 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應的融解曲線55-56
• 3.3.7 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法的特異性試驗結果56
• 3.3.8 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法的敏感性試驗結果56-58
• 3.3.9 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測方法的重復性試驗結果58-59
• 3.3.10 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR方法的臨床樣本檢測試驗結果59-60
• 3.4 討論60-64
• 3.4.1 建立SYBR Green-I熒光定量PCR方法檢測乳房炎白色念珠菌的重要性60
• 3.4.2 白色念珠菌目的基因的選擇60-61
• 3.4.3 白色念珠菌DNA的提取61
• 3.4.4 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應的融解曲線分析61-62
• 3.4.5 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR方法的靈敏性、特異性、重復性及臨床檢測結果分析62-63
• 3.4.6 熒光定量PCR技術診斷白色念珠菌63-64
• 全文結論64-65
• 參考文獻65-72
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文72-73
• 致謝73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 夏乾峰;傅瓊瑤;鄔強;覃西;姚茂忠;黃綿慶;邢桂蘭;錢士勻;;熒光定量PCR定量檢測5種假絲酵母菌方法的建立[J];檢驗醫(yī)學;2015年03期

2 游亞蘭;賀湘玲;方亦兵;張兵;鄧中平;鐘禮立;劉華;朱秀娟;鄒潤英;田鑫;鄒惠;;白色念珠菌實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測體系的建立[J];檢驗醫(yī)學與臨床;2015年06期

3 杜向宏;尹南男;左宗輝;杜玉蘭;楊蓉;趙熠珩;陳亞明;何寶祥;;奶牛GPR109A基因SYBR GreenI實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J];南方農業(yè)學報;2015年03期

4 魯勇;汪一萍;應建飛;俞燕紅;賀明陽;;環(huán)介導等溫擴增快速檢測臨床假絲酵母菌屬方法建立與應用[J];中華醫(yī)院感染學雜志;2015年06期

5 王建東;劉溪源;楊慧君;康曉冬;;利用VITEK-2高級專家系統(tǒng)鑒定奶牛隱性乳房炎致病菌及其耐藥性分析[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;2015年01期

6 覃杰;龍杰;張偉;;鐵門關地區(qū)奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及體外抑菌試驗[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年02期

7 彭孝斌;;甘油-生理鹽水保存菌種方法介紹[J];預防醫(yī)學情報雜志;2014年11期

8 李桂民;;基于LUX引物的HBV實時PCR檢測方法的建立[J];激光生物學報;2014年03期

9 李娜;李春龍;毛文斌;許鐵男;周玉龍;朱戰(zhàn)波;樸范澤;;奶牛場群發(fā)真菌性乳房炎的病原分離鑒定及藥敏試驗[J];中國奶牛;2014年06期

10 竇紅濤;肖盟;范欣;楊啟文;王瑤;王賀;劉娟;謝秀麗;徐英春;;BD Phoenix~(TM)酵母菌鑒定板對臨床分離酵母菌鑒定能力的評估[J];中國真菌學雜志;2013年05期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 游亞蘭;念珠菌與新型隱球菌實時熒光定量PCR檢測體系的建立[D];南華大學;2013年

2 張園;新疆北疆部分地區(qū)奶牛乳房炎病原真菌的調查[D];石河子大學;2008年

3 賈玉萍;奶牛乳房炎病原菌快速檢測及藥物敏感性試驗方法研究[D];山東農業(yè)大學;2005年

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本文編號：706055