本文關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎酵母樣真菌的分離鑒定與熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

  更多相關(guān)文章： 乳房炎 藥敏試驗(yàn) 白色念珠菌 熒光定量PCR

【摘要】：奶牛真菌性乳房炎常因誤診耽誤正確的治療而變成頑固性乳房炎。為調(diào)查南寧市某牛場(chǎng)奶牛乳房炎酵母樣真菌的感染情況以及主要病原真菌種類,本試驗(yàn)采集該牛場(chǎng)乳樣198份,經(jīng)體細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè),結(jié)合奶牛產(chǎn)奶量,臨床表現(xiàn),乳樣外觀等,檢測(cè)到臨床型乳房炎乳樣92份(46.46%),隱性乳房炎乳樣17份(8.58%),對(duì)這些乳樣進(jìn)行酵母樣真菌的分離鑒定,其中有51份乳樣中分離到酵母樣真菌。經(jīng)假菌絲及酵母樣真菌生化管鑒定,查看TH 15-C酵母樣真菌生化鑒定編碼冊(cè),鑒定結(jié)果如下：37份乳樣中分離到白色念珠菌(72.54%),6份乳樣中分離到砝碼念珠菌(11.76%),6份乳樣中分離到奧么畢赤酵母菌(11.76%),2份乳樣中分離到膠粘紅酵母菌(3.94%)。隨機(jī)選取21株臨床分離酵母樣真菌菌株,用4種抗真菌藥敏紙片和4種抗生素藥敏紙片對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果它們均對(duì)制霉菌素有較高的敏感性,大部分菌株對(duì)兩性霉素B、酮康唑中度敏感,幾乎全部菌株對(duì)氟康唑以及丁胺卡那、頭孢曲松、慶大霉素、鏈霉素耐藥。本試驗(yàn)結(jié)果為南寧市該牛場(chǎng)乳房炎酵母樣真菌感染的治療提供了用藥參考,且為此類乳房炎的綜合防治提供了理論基礎(chǔ)。奶牛真菌性乳房炎會(huì)給奶牛乳房組織造成不同程度的、不可逆轉(zhuǎn)的病理性損傷,甚至導(dǎo)致奶牛被淘汰或死亡。其中白色念珠菌是引起奶牛真菌性乳房炎的最主要致病菌之一。臨床上仍然使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)白色念珠菌,該方法耗時(shí)較長,可能會(huì)延誤治療而導(dǎo)致動(dòng)物病情加重。故有必要建立一種可以快速準(zhǔn)確診斷奶牛乳房炎白色念珠菌的方法。本研究依據(jù)白色念珠菌的ITS 2序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,建立了可以快速診斷白色念珠菌的SYBR Green-I熒光定量PCR方法。本試驗(yàn)所得白色念珠菌熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.448x+39.72,其線性系數(shù)R2=1.00,其擴(kuò)增效率為95%,可檢測(cè)白色念珠菌質(zhì)粒的最低濃度為1.03×101拷貝/uL。通過融解曲線分析確定該反應(yīng)白色念珠菌的Tm值為87.25℃-88.25℃。使用本試驗(yàn)建立的SYBR Green-I熒光定量PCR反應(yīng)分別對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,無乳鏈球菌等多種乳房炎致病菌進(jìn)行擴(kuò)增,均無融解曲線產(chǎn)生,證明該反應(yīng)的特異性良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果,五個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.90%,0.39%,0.34%,0.13%,0.12%,批間變異系數(shù)分別為0.21%,0.26%,0.37%,0.13%,0.19%,均在5%以下,證明該反應(yīng)的重復(fù)性良好。對(duì)40份臨床乳樣進(jìn)行檢測(cè),以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),本試驗(yàn)建立的白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR方法的敏感性、特異性、符合率分別為100%,90.91%,96.77%。以普通PCR方法為標(biāo)準(zhǔn),本試驗(yàn)建立的SYBR Green-I熒光定量PCR方法的敏感性、特異性、符合率分別為90.32%,100%,93.02%。以上結(jié)果表明,本試驗(yàn)建立的奶牛乳房炎白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性。本試驗(yàn)為奶牛乳房炎白色念珠菌的早期快速定量診斷提供了科學(xué)依據(jù),但若要將其應(yīng)用于臨床診斷還需進(jìn)行大量實(shí)踐研究。
【關(guān)鍵詞】：乳房炎 藥敏試驗(yàn) 白色念珠菌 熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.23
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 英文縮略詞表15-16
• 第一章 緒論16-33
• 1.1 奶牛酵母樣真菌性乳房炎16-20
• 1.1.1 奶牛酵母樣真菌性乳房炎概述16-17
• 1.1.2 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的病因17-18
• 1.1.3 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的臨床特征18
• 1.1.4 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的流行病學(xué)調(diào)查18-19
• 1.1.5 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的診斷19-20
• 1.1.6 奶牛酵母樣真菌性乳房炎的防治20
• 1.2 白色念珠菌20-25
• 1.2.1 白色念珠菌的生物學(xué)特性20-21
• 1.2.2 白色念珠菌診斷方法概述21-25
• 1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)25-31
• 1.3.1 熒光定量PCR技術(shù)的原理25-26
• 1.3.2 熒光定量PCR技術(shù)的分類26-28
• 1.3.3 熒光定量PCR技術(shù)的定量方法28-29
• 1.3.4 融解曲線分析29-30
• 1.3.5 熒光定量PCR技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用30-31
• 1.4 本研究的目的和意義31-33
• 第二章 南寧市某奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎酵母樣真菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)33-43
• 2.1 試驗(yàn)材料33-34
• 2.1.1 試驗(yàn)試劑33
• 2.1.2 試驗(yàn)設(shè)備33-34
• 2.1.3 主要試劑的配制34
• 2.2 試驗(yàn)方法34-36
• 2.2.1 乳樣的來源34
• 2.2.2 乳樣的采集34-35
• 2.2.3 乳樣的分裝35
• 2.2.4 乳樣的SCC檢測(cè)35
• 2.2.5 乳樣酵母樣真菌的分離35
• 2.2.6 乳樣酵母樣真菌的鑒定35
• 2.2.7 菌種的保存35-36
• 2.2.8 臨床分離酵母樣真菌菌株的藥敏試驗(yàn)36
• 2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析36
• 2.3 結(jié)果36-40
• 2.3.1 乳樣SCC檢測(cè)結(jié)果36-37
• 2.3.2 乳樣中酵母樣真菌分離結(jié)果37-38
• 2.3.3 乳樣中酵母樣真菌鑒定結(jié)果38-40
• 2.3.4 臨床分離酵母樣真菌菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果40
• 2.4 討論40-43
• 第三章 奶牛乳房炎白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用43-64
• 3.1 材料43-46
• 3.1.1 試驗(yàn)菌株43
• 3.1.2 試驗(yàn)試劑43-44
• 3.1.3 試驗(yàn)設(shè)備44
• 3.1.4 試驗(yàn)試劑配方44-46
• 3.2 試驗(yàn)方法46-51
• 3.2.1 白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的活化46
• 3.2.2 菌株DNA模板的提取46
• 3.2.3 引物的設(shè)計(jì)46-47
• 3.2.4 普通PCR反應(yīng)體系的建立47
• 3.2.5 普通PCR產(chǎn)物的鑒定47
• 3.2.6 普通PCR產(chǎn)物膠回收47-48
• 3.2.7 pEasy-T1載體連接和轉(zhuǎn)化48-49
• 3.2.8 質(zhì)粒的提取49
• 3.2.9 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及融解曲線的建立49-50
• 3.2.10 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)50
• 3.2.11 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)50
• 3.2.12 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)50-51
• 3.2.13 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法臨床樣品檢測(cè)的初步應(yīng)用51
• 3.2.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析51
• 3.3 結(jié)果51-60
• 3.3.1 白色念珠菌PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化結(jié)果51-52
• 3.3.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證52-53
• 3.3.3 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果53-54
• 3.3.4 白色念珠菌部分核酸序列重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果54
• 3.3.5 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線54-55
• 3.3.6 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應(yīng)的融解曲線55-56
• 3.3.7 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果56
• 3.3.8 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果56-58
• 3.3.9 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果58-59
• 3.3.10 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR方法的臨床樣本檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果59-60
• 3.4 討論60-64
• 3.4.1 建立SYBR Green-I熒光定量PCR方法檢測(cè)乳房炎白色念珠菌的重要性60
• 3.4.2 白色念珠菌目的基因的選擇60-61
• 3.4.3 白色念珠菌DNA的提取61
• 3.4.4 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR反應(yīng)的融解曲線分析61-62
• 3.4.5 白色念珠菌SYBR Green-I熒光定量PCR方法的靈敏性、特異性、重復(fù)性及臨床檢測(cè)結(jié)果分析62-63
• 3.4.6 熒光定量PCR技術(shù)診斷白色念珠菌63-64
• 全文結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文72-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：706055