本文關(guān)鍵詞：診斷家畜日本血吸蟲病膠體金免疫層析試紙條的研制

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【摘要】：血吸蟲病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。家畜血吸蟲病診斷技術(shù)主要為病原學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷。但隨著感染強度的不斷下降,傳統(tǒng)的診斷方法越來越不適用于現(xiàn)場應(yīng)用。為適應(yīng)基層血吸蟲病篩查和普查的需要,有必要研制針對多種動物的快速檢測試劑盒。膠體金免疫層析技術(shù)因其具有簡便、快速、敏感、特異、無需特殊儀器等優(yōu)點而適于疫區(qū)現(xiàn)場大規(guī)模篩查。本課題目的是研制一種敏感性高、特異性強能夠檢測多種動物日本血吸蟲病的試紙條。根據(jù)鏈球菌蛋白G(SPG)具有與多種動物的IgG結(jié)合特性,對鏈球菌蛋白G進行生物學(xué)分析,設(shè)計重組蛋白G(rSPG)的基因序列,構(gòu)建rSPG的2種原核表達質(zhì)粒,并在大腸桿菌中表達,得到帶有GST和His標(biāo)簽的融合蛋白,通過親和層析純化蛋白。Western blotting的結(jié)果顯示,兩種rSPG均有與IgG結(jié)合的能力。ELISA測定2種帶有不同標(biāo)簽的rSPG與牛、山羊、兔、鼠四個物種IgG的親和力,顯示帶有GST標(biāo)簽的重組蛋白G的親和力普遍高于商品化鏈球菌蛋白G,帶有His標(biāo)簽的重組蛋白G的親和力與商品化鏈球菌蛋白G相比基本一致。將兩種重組蛋白G進行膠體金標(biāo)記蛋白的最佳pH值、最佳標(biāo)記量的確定,最后選用His-rSPG進行膠體金的標(biāo)記及制備金標(biāo)墊。分別用可溶性蟲卵抗原(SEA)和His-rSPG作為檢測線和質(zhì)控線,確定其最佳劃線濃度與血清最佳稀釋度。結(jié)果表明,膠體金標(biāo)記蛋白的最佳pH值為5.0、最佳標(biāo)記量為10μg/ml;檢測線和質(zhì)控線的最佳劃線濃度均為0.5 mg/mL;血清最佳稀釋度為1:20。用組裝好的試紙條檢測標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性BALB/c鼠與新西蘭大白兔血清,以及糞檢陰、陽性的山羊血清、水牛血清,評估其敏感性和特異性;用膠體金免疫層析試紙條法(GICA法)檢測前后盤吸蟲病牛血清、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病羊血清、東畢吸蟲病羊血清,并與ELISA法相比較,評價其交叉反應(yīng)性。為進一步對試紙條進行評價,分別用GICA法和ELISA法分別對不同感染強度的水牛血清進行檢測。對于血紙的評價,用實驗室人工感染的水牛陰、陽性血紙和從疫區(qū)采集的水牛血紙分別用GICA法和ELISA法進行檢測,評估檢測效果。結(jié)果表明,以重組蛋白G制備的試紙條可用于檢測日本血吸蟲感染BALB/c鼠、新西蘭大白兔、水牛、山羊血清抗體。該試紙條檢測日本血吸蟲感染小鼠與兔血清的敏感性、特異型均為100.00%。檢測山羊血清的敏感性為100.00%,與ELISA法相同;特異性為88.64%,高于ELISA法的75.00%。檢測水牛血清的敏感性為100.00%,與ELISA法相同;特異性為94.23%,高于ELISA法的84.62%。其與前后盤吸蟲交叉反應(yīng)率為14.29%;與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲交叉反應(yīng)性為16.67%;與東畢吸蟲的交叉反應(yīng)性為33.33%。在對不同感染強度的水牛血清進行評估時,GICA法和ELISA法檢測日本血吸蟲感染的水牛血清其特異性均為100.00%。在感染強度20條/頭時,GICA法的敏感性為75.00%低于ELISA法的100.00%。在感染強度20條/頭時,GICA法和ELISA法的敏感性均為100.00%。對水牛血紙進評估時,對于實驗室人工感染水牛血紙GICA法和ELISA法的敏感性和特異性均為100.00%,并且兩種方法之間無統(tǒng)計學(xué)差異。綜上,本研究成功表達了重組鏈球菌蛋白G,并研制出能檢測多種家畜血吸蟲病的膠體金免疫層析試紙條,其檢測家畜血吸蟲感染的敏感性和特異性均較高。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 鏈球菌蛋白G 免疫診斷 膠體金免疫層析試紙條
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S855.9
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-22
• 1.1 血吸蟲病概述13-14
• 1.2 日本血吸蟲病診斷方法14-18
• 1.2.1 病原學(xué)診斷14
• 1.2.2 免疫學(xué)診斷14-16
• 1.2.3 分子生物學(xué)診斷16-18
• 1.3 膠體金免疫層析試驗18-22
• 1.3.1 膠體金的發(fā)現(xiàn)18
• 1.3.2 膠體金的性質(zhì)及制備18-19
• 1.3.3 膠體金探針的制備19
• 1.3.4 膠體金免疫檢測技術(shù)19-20
• 1.3.5 膠體金免疫層析技術(shù)的應(yīng)用20-22
• 第二章 鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)域重構(gòu)、表達及鑒定22-37
• 2.1 引言22
• 2.2 實驗材料22-26
• 2.2.1 生物材料22
• 2.2.2 儀器設(shè)備22-23
• 2.2.3 酶和試劑23
• 2.2.4 試劑配制23-26
• 2.3 實驗方法26-29
• 2.3.1 重組蛋白G的構(gòu)建26
• 2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達26-28
• 2.3.3 重組蛋白的純化28
• 2.3.4 Western blotting檢測重組蛋白與IgG的結(jié)合活性28-29
• 2.3.5 ELISA法測定重組蛋白與不同物種IgG親和常數(shù)29
• 2.4 結(jié)果29-35
• 2.4.1 重組蛋白G原核表達質(zhì)粒構(gòu)建29-30
• 2.4.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達和可溶性鑒定30-32
• 2.4.3 重組蛋白的純化32
• 2.4.4 重組蛋白與IgG結(jié)合活力測定32-33
• 2.4.5 ELISA法測定重組蛋白與不同物種IgG親和常數(shù)33-35
• 2.5 討論35-37
• 第三章 膠體金免疫層析試紙條的組裝及優(yōu)化37-48
• 3.1 引言37
• 3.2 實驗材料37-38
• 3.2.1 生物材料37
• 3.2.2 儀器設(shè)備37
• 3.2.3 酶和試劑37-38
• 3.2.4 試劑配制38
• 3.3 實驗方法38-41
• 3.3.1 膠體金的燒制38
• 3.3.2 可溶性蟲卵抗原（SEA）的制備38-39
• 3.3.3 膠體金標(biāo)記的最佳PH值39
• 3.3.4 膠體金標(biāo)記的最佳蛋白標(biāo)記量39
• 3.3.5 膠體金探針的制備39-40
• 3.3.6 膠體金免疫層析試紙條的制備及優(yōu)化40-41
• 3.3.7 膠體金免疫層析試紙條保存41
• 3.4 結(jié)果41-46
• 3.4.1 膠體金顆粒的鑒定41-42
• 3.4.2 膠體金標(biāo)記蛋白的最佳PH值及最佳蛋白標(biāo)記量42-44
• 3.4.3 穩(wěn)定液及重懸液的選擇44
• 3.4.4 金標(biāo)墊及樣品墊的選擇44-45
• 3.4.5 檢測線、質(zhì)控線及血清最佳用量45-46
• 3.5 討論46-48
• 第四章 膠體金免疫層析試紙條的初步應(yīng)用48-56
• 4.1 引言48
• 4.2 實驗材料48-49
• 4.2.1 生物材料48
• 4.2.2 儀器設(shè)備48
• 4.2.3 酶和試劑48
• 4.2.4 試劑配制48-49
• 4.3 實驗方法49-51
• 4.3.1 GICA法對實驗動物血吸蟲病的檢測49
• 4.3.2 GICA法對水牛、山羊血吸蟲病的檢測49
• 4.3.3 GICA法對水牛不同感染強度的血吸蟲病檢測49
• 4.3.4 試紙條交叉反應(yīng)性的初步評價49-50
• 4.3.5 GICA法對水牛血紙的檢測50
• 4.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析50
• 4.3.7 膠體金免疫層析試紙條的穩(wěn)定性實驗50-51
• 4.3.8 膠體金免疫層析試紙條的重復(fù)性實驗51
• 4.4 實驗結(jié)果51-55
• 4.4.1 GICA法檢測的敏感性、特異性51-52
• 4.4.2 對水牛不同感染強度的檢測52-53
• 4.4.3 交叉反應(yīng)性53
• 4.4.4 對水牛血紙檢測53-54
• 4.4.5 穩(wěn)定性實驗54-55
• 4.4.6 重復(fù)性實驗55
• 4.5 討論55-56
• 第五章 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻57-63
• 致謝63-64
• 作者簡歷64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳小鋒,劉曙照;膠體金標(biāo)記免疫分析及其在小分子化合物快速檢測中的應(yīng)用[J];藥物生物技術(shù);2004年04期

2 丁建祖,干小仙,沈慧英,沈麗英,俞澗;快速檢測抗日本血吸蟲抗體的金標(biāo)免疫滲濾法的建立及應(yīng)用[J];中國寄生蟲病防治雜志;1998年04期

3 曹之舫;武建國;;鏈球菌蛋白G——一種優(yōu)于葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合物[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);1989年05期

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本文編號：680705