本文關(guān)鍵詞：TLR4在母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞中作用的初步研究

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【摘要】：非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacterium,NTM)廣泛存在于自然界中,是不同于麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核桿菌復(fù)合群的另一種分枝桿菌。由于最近幾年NTM在感染的動(dòng)物和人體組織內(nèi)的分離率逐漸升高,引起人們的廣泛重視。結(jié)核分枝桿菌入侵機(jī)體之后感染的主要細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。當(dāng)細(xì)菌入侵機(jī)體時(shí),可通過Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞使絲裂原蛋白激酶信號(hào)激活,最后使核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)激活,刺激多種細(xì)胞因子釋放,調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前關(guān)于NTM的研究主要集中在流行病學(xué)的調(diào)查、細(xì)菌耐藥性分析、細(xì)菌鑒別和疾病診斷方面,而對(duì)于NTM的致病機(jī)制研究這方面卻相對(duì)較少。母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)是非結(jié)核分枝桿菌的一種,為探討NTM是否通過TLR調(diào)控炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),本研究通過母牛分枝桿菌進(jìn)行了以下工作:首先,將從臨床牛的腸系膜淋巴結(jié)中分離出的母牛分枝桿菌,重新培養(yǎng)并進(jìn)行菌種鑒定。建立母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7模型,利用熒光定量PCR技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)菌株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7刺激后TLR4表達(dá)量的變化,再利用ELISA技術(shù)測(cè)定細(xì)菌感染前后細(xì)胞上清中TNF-α和IFN-γ的表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:母牛分枝桿菌感染可上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR4表達(dá)量,并且隨時(shí)間其表達(dá)量發(fā)生改變;母牛分枝桿菌感染可上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中TNF-α和IFN-γ表達(dá)。這一結(jié)果預(yù)測(cè)母牛分枝桿菌可能通過TLR4介導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中細(xì)胞因子的表達(dá)。采用ELISA方法測(cè)定母牛分枝桿菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 6h后不同細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果表明:母牛分枝桿菌感染可激活小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7上調(diào)IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá);TLR4阻斷劑預(yù)處理后,繼續(xù)測(cè)定相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示:TLR4阻斷劑能夠顯著抑制母牛分枝桿菌誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 IL-4和IL-10細(xì)胞因子的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)到IL-1β表達(dá)量顯著增高,而IFN-γ和TNF-α的表達(dá)并無明顯變化,這一結(jié)果表明母牛分枝桿菌誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7表達(dá)IL-4和IL-10的過程可能是依賴TLR4完成的,并且TLR4的激活可能對(duì)于IL-1β的表達(dá)產(chǎn)生抑制。同時(shí),采用熒光定量PCR技術(shù)和免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)在母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7過程中,RAW264.7細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子mRNA和蛋白表達(dá)量的變化情況,探討其是否激活RAW264.7細(xì)胞MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:母牛分枝桿菌感染可上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中MyD88mRNA、TRAF6mRNA和NF-κBm RNA表達(dá)水平,其中TRIFm RNA表達(dá)低于對(duì)照組;母牛分枝桿菌能夠誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7使ERK1/2、p38、JNK和NF-κB信號(hào)信號(hào)通路激活,顯著上調(diào)相應(yīng)蛋白磷磷酸化水平。隨后利用TLR4阻斷劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,探討母牛分枝桿菌激活小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7相關(guān)信號(hào)通路傳導(dǎo)是否通過TLR4介導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:TLR4阻斷劑可抑制細(xì)胞內(nèi)MyD88mRNA和TRAF6mRNA表達(dá),上調(diào)NF-κBm RNA表達(dá),TRIFmRNA表達(dá)無顯著變化;TLR4阻斷劑可顯著降低母牛分枝桿菌誘導(dǎo)的ERK1/2和p38磷酸化水平,JNK磷酸化水平無明顯改變,NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。以上結(jié)果預(yù)示著母牛分枝桿菌可能激活MyD88依賴性和MyD88非依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑,并且通過TLR4介導(dǎo)ERK1/2和p38信號(hào)通路的激活,但TLR4的激活可能抑制母牛分枝桿菌感染的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中NF-κB信號(hào)通路的激活。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)首次以母牛分枝桿菌初步探討了非結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞相互作用的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),母牛分枝桿菌感染可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7上調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)以及激活相關(guān)信號(hào)通路傳導(dǎo),并且這些過程可能通過依賴TLR4介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。本研究將為揭示機(jī)體抗NTM感染相關(guān)機(jī)制的研究提供科學(xué)數(shù)據(jù),為進(jìn)一步研究NTM病的免疫機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：母牛分枝桿菌 巨噬細(xì)胞 TLR4 MAPK NF-κB
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-10
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1 非結(jié)核分枝桿菌概述10-13
• 2 TLRS在宿主抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮的免疫機(jī)制13-18
• 3 與 MTB 感染有關(guān)的主要細(xì)胞因子18-21
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容21-58
• 第一章 母牛分枝桿菌感染對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TLR4和細(xì)胞因子表達(dá)的影響21-40
• 1.1 材料和方法21-28
• 1.2.結(jié)果28-38
• 1.3 討論38-39
• 1.4 小結(jié)39-40
• 第二章 TLR4在母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞中作用的研究40-58
• 2.1 材料和方法40-44
• 2.2 結(jié)果44-55
• 2.3 討論55-57
• 2.4 小結(jié)57-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-68
• 作者簡(jiǎn)介68-69
• 致謝69

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本文編號(hào)：670313