本文關鍵詞：TLR4在母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細胞中作用的初步研究

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【摘要】：非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacterium,NTM)廣泛存在于自然界中,是不同于麻風分枝桿菌、結(jié)核桿菌復合群的另一種分枝桿菌。由于最近幾年NTM在感染的動物和人體組織內(nèi)的分離率逐漸升高,引起人們的廣泛重視。結(jié)核分枝桿菌入侵機體之后感染的主要細胞是巨噬細胞。當細菌入侵機體時,可通過Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)介導巨噬細胞使絲裂原蛋白激酶信號激活,最后使核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)激活,刺激多種細胞因子釋放,調(diào)節(jié)機體的細胞免疫應答。目前關于NTM的研究主要集中在流行病學的調(diào)查、細菌耐藥性分析、細菌鑒別和疾病診斷方面,而對于NTM的致病機制研究這方面卻相對較少。母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)是非結(jié)核分枝桿菌的一種,為探討NTM是否通過TLR調(diào)控炎癥反應和介導相關信號通路的轉(zhuǎn)導,本研究通過母牛分枝桿菌進行了以下工作:首先,將從臨床牛的腸系膜淋巴結(jié)中分離出的母牛分枝桿菌,重新培養(yǎng)并進行菌種鑒定。建立母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細胞RAW264.7模型,利用熒光定量PCR技術與流式細胞術檢測菌株對小鼠巨噬細胞RAW264.7刺激后TLR4表達量的變化,再利用ELISA技術測定細菌感染前后細胞上清中TNF-α和IFN-γ的表達量的變化。實驗結(jié)果表明:母牛分枝桿菌感染可上調(diào)小鼠巨噬細胞RAW264.7 TLR4表達量,并且隨時間其表達量發(fā)生改變;母牛分枝桿菌感染可上調(diào)小鼠巨噬細胞RAW264.7中TNF-α和IFN-γ表達。這一結(jié)果預測母牛分枝桿菌可能通過TLR4介導小鼠巨噬細胞RAW264.7中細胞因子的表達。采用ELISA方法測定母牛分枝桿菌刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7 6h后不同細胞因子IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的表達情況。結(jié)果表明:母牛分枝桿菌感染可激活小鼠巨噬細胞RAW264.7上調(diào)IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等細胞因子的表達;TLR4阻斷劑預處理后,繼續(xù)測定相關細胞因子的表達量變化。結(jié)果顯示:TLR4阻斷劑能夠顯著抑制母牛分枝桿菌誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7 IL-4和IL-10細胞因子的表達,同時檢測到IL-1β表達量顯著增高,而IFN-γ和TNF-α的表達并無明顯變化,這一結(jié)果表明母牛分枝桿菌誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7表達IL-4和IL-10的過程可能是依賴TLR4完成的,并且TLR4的激活可能對于IL-1β的表達產(chǎn)生抑制。同時,采用熒光定量PCR技術和免疫印跡試驗(Western Blot)檢測在母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細胞RAW264.7過程中,RAW264.7細胞內(nèi)信號通路中關鍵分子mRNA和蛋白表達量的變化情況,探討其是否激活RAW264.7細胞MAPK信號通路和NF-κB信號通路的轉(zhuǎn)導。實驗結(jié)果表明:母牛分枝桿菌感染可上調(diào)小鼠巨噬細胞RAW264.7中MyD88mRNA、TRAF6mRNA和NF-κBm RNA表達水平,其中TRIFm RNA表達低于對照組;母牛分枝桿菌能夠誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7使ERK1/2、p38、JNK和NF-κB信號信號通路激活,顯著上調(diào)相應蛋白磷磷酸化水平。隨后利用TLR4阻斷劑對細胞進行預處理,探討母牛分枝桿菌激活小鼠巨噬細胞RAW264.7相關信號通路傳導是否通過TLR4介導。實驗結(jié)果表明:TLR4阻斷劑可抑制細胞內(nèi)MyD88mRNA和TRAF6mRNA表達,上調(diào)NF-κBm RNA表達,TRIFmRNA表達無顯著變化;TLR4阻斷劑可顯著降低母牛分枝桿菌誘導的ERK1/2和p38磷酸化水平,JNK磷酸化水平無明顯改變,NF-κB蛋白表達水平顯著上調(diào)。以上結(jié)果預示著母牛分枝桿菌可能激活MyD88依賴性和MyD88非依賴性信號傳導途徑,并且通過TLR4介導ERK1/2和p38信號通路的激活,但TLR4的激活可能抑制母牛分枝桿菌感染的小鼠巨噬細胞RAW264.7中NF-κB信號通路的激活。綜上所述,本實驗首次以母牛分枝桿菌初步探討了非結(jié)核分枝桿菌與巨噬細胞相互作用的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),母牛分枝桿菌感染可誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7上調(diào)細胞因子表達以及激活相關信號通路傳導,并且這些過程可能通過依賴TLR4介導實現(xiàn)。本研究將為揭示機體抗NTM感染相關機制的研究提供科學數(shù)據(jù),為進一步研究NTM病的免疫機制提供一定的理論基礎。
【關鍵詞】：母牛分枝桿菌 巨噬細胞 TLR4 MAPK NF-κB
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-10
• 第一篇 文獻綜述10-21
• 1 非結(jié)核分枝桿菌概述10-13
• 2 TLRS在宿主抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮的免疫機制13-18
• 3 與 MTB 感染有關的主要細胞因子18-21
• 第二篇 研究內(nèi)容21-58
• 第一章 母牛分枝桿菌感染對小鼠巨噬細胞TLR4和細胞因子表達的影響21-40
• 1.1 材料和方法21-28
• 1.2.結(jié)果28-38
• 1.3 討論38-39
• 1.4 小結(jié)39-40
• 第二章 TLR4在母牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細胞中作用的研究40-58
• 2.1 材料和方法40-44
• 2.2 結(jié)果44-55
• 2.3 討論55-57
• 2.4 小結(jié)57-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-68
• 作者簡介68-69
• 致謝69

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本文編號：670313