本文關(guān)鍵詞：表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定

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【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,在我國(guó)豬群中廣泛存在,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前用于防控PCV2感染的疫苗主要包括滅活疫苗和亞單位疫苗。近年來,PCV2與偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)混合感染十分普遍,造成仔豬嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病以及母豬繁殖障礙,新出現(xiàn)的PRV變異強(qiáng)毒株給臨床防控提出新的挑戰(zhàn)和難題。本研究以PRV為病毒活載體,將PCV2 Cap蛋白基因插入PRV基因組內(nèi),以期構(gòu)建能夠表達(dá)高水平PCV2 Cap蛋白的重組PRV病毒,旨在為這兩種病毒性疫病的防控提供一種基因工程疫苗。研究表明,PRV胸苷激酶(TK)基因是病毒毒力相關(guān)基因,該基因缺失對(duì)病毒復(fù)制能力沒有明顯影響,但使其毒力大大降低。我們首選PRV TK基因作為靶點(diǎn),在缺失該基因的同時(shí)替換插入PCV2 Cap基因,構(gòu)建了一種表達(dá)PCV2 Cap蛋白基因的重組PRV TK缺失毒株。本研究構(gòu)建了2個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(TK)-EGFP和pMD18T-LR(TK)-Cap,前者包含缺失TK基因的左右同源臂和EGFP表達(dá)盒,后者包含缺失TK基因的左右同源臂和Cap蛋白表達(dá)盒。將pMD18T-LR(TK)-EGFP和PRV-JF毒株的基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,經(jīng)同源重組方法用EGFP表達(dá)盒替換TK基因,經(jīng)綠色熒光蝕斑篩選和PCR鑒定,篩選獲得缺失TK基因的重組病毒rPRV-TK-/EGFP+。以該重組毒株為材料,經(jīng)同源重組方法用PCV2 Cap表達(dá)盒再替換EGFP表達(dá)盒,經(jīng)無綠色熒光蝕斑反式篩選和PCR鑒定,獲得表達(dá)PCV2 Cap表達(dá)盒的重組病毒rPRV-TK-/Cap+。用PCV2 Cap蛋白特異性單克隆抗體進(jìn)行IPMA方法鑒定PCV2 Cap蛋白的表達(dá),結(jié)果檢測(cè)不到Cap蛋白的表達(dá),證實(shí)該重組毒株不能表達(dá)Cap蛋白,分析可能與插入的位點(diǎn)或者表達(dá)盒有關(guān)。為了進(jìn)一步構(gòu)建能高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組PRV,又以rPRV-TK-/Cap+重組病毒為材料,選擇PRV gE基因?yàn)樾碌牟迦氚悬c(diǎn)。首先構(gòu)建了2個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(gE)-EGFP和pMD18T-LR(gE)-Cap(CI),前者包含缺失gE基因的左右同源臂和EGFP表達(dá)盒,后者包含缺失gE基因的左右同源臂和Cap蛋白表達(dá)盒。將重組轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(gE)-EGFP與重組病毒rPRV-TK-/Cap+基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,經(jīng)同源重組方法用EGFP表達(dá)盒替換gE基因,通過綠色熒光蝕斑篩選和PCR鑒定,獲得TK、gE雙基因缺失的重組毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/EGFP+。以該重組毒為材料,將重組轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(gE)-Cap(CI)與其基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,經(jīng)無綠色熒光蝕斑反向篩選和PCR鑒定,獲得TK、gE雙基因缺失含有兩個(gè)Cap蛋白表達(dá)盒的重組毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)。經(jīng)IPMA和Western blot試驗(yàn)檢測(cè)Cap蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示用Cap蛋白特異性單克隆抗體可以檢測(cè)到Cap蛋白的表達(dá),表明該重組病毒能有效地表達(dá)Cap蛋白。為了進(jìn)一步增強(qiáng)Cap蛋白的表達(dá)量,本研究從改變Cap蛋白表達(dá)盒的啟動(dòng)子和優(yōu)化Cap基因密碼子兩方面,經(jīng)同源重組方法構(gòu)建了攜帶Cap蛋白復(fù)合啟動(dòng)子表達(dá)盒的重組病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CA)和攜帶Cap蛋白密碼子優(yōu)化表達(dá)盒的重組病毒rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA)。經(jīng)IPMA和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,上述兩種重組毒均可以有效地表達(dá)Cap蛋白,然而這3種重組毒株rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CI)、rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+(CA)和rPRV-TK-/Cap+/gE-/Cap+opti(CA)Cap表達(dá)量的差異并不顯著。一步PRV-JF的要弱。用構(gòu)建的重組毒株接種家兔顯示其毒力明顯降低,表明對(duì)家兔是安全的,具備了作為疫苗研制的可能。UL42蛋白是PRV病毒DNA聚合酶的輔助亞基,對(duì)病毒復(fù)制是必需的。UL42的體外功能已被證實(shí),有關(guān)UL42的單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位到目前仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室制備了6株針對(duì)UL42蛋白的單抗(2D5、4E2、2G11、5F8、7C11和8F9),通過Western blot和ELISA方法對(duì)這些單抗識(shí)別的抗原表位進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示,有兩個(gè)區(qū)域的氨基酸(aa)(39~148 aa和302~384 aa)能與UL42單抗反應(yīng)。通過合成一系列針對(duì)這兩個(gè)區(qū)域的短肽,最終鑒定出了這6株單抗能夠識(shí)別3個(gè)抗原表位,其中表位116SGGVLDALK124位于UL42的氨基端,而354KRPAAPR360和360RMYTPIAK367位于UL42的羧基端。氨基酸序列分析顯示,這3個(gè)表位在不同的PRV毒株間是高度保守的。此外,用這些單抗建立的間接免疫熒光試驗(yàn)法檢測(cè)到UL42蛋白在病毒的復(fù)制過程中定位于細(xì)胞核內(nèi);用這些單抗進(jìn)行的免疫沉淀試驗(yàn)可將UL42蛋白從感染PRV的PK-15細(xì)胞中沉淀出來;用這些單抗還建立了一種新的IPMA方法可用于PRV病毒含量測(cè)定。因此,這些單抗在UL42蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究中提供了非常有用的工具。
【關(guān)鍵詞】：豬圓環(huán)病毒2型 重組偽狂犬病病毒 Cap蛋白 抗原表位
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 英文縮略表13-14
• 第一章 緒論14-29
• 1.1 豬圓環(huán)病毒概況14-15
• 1.1.1 致病性14
• 1.1.2 病原學(xué)14-15
• 1.2 豬圓環(huán)病毒疫苗的研究進(jìn)展15-20
• 1.2.1 滅活疫苗16
• 1.2.2 弱毒疫苗16-17
• 1.2.3 基因工程疫苗17-20
• 1.2.4 展望20
• 1.3 偽狂犬病病毒概況20-22
• 1.3.1 致病性20-21
• 1.3.2 病原學(xué)21-22
• 1.4 以PRV為載體的重組疫苗研究進(jìn)展22-27
• 1.4.1 重組的PCV2/PRV的研究25
• 1.4.2 重組的PRRSV/PRV的研究25-26
• 1.4.3 重組的CSFV/PRV的研究26
• 1.4.4 重組的PPV/PRV的研究26
• 1.4.5 重組的FDMV/PRV的研究26-27
• 1.4.6 其它的重組的病毒27
• 1.4.7 展望27
• 1.5 研究目的和意義27-29
• 第二章 表達(dá)單個(gè)PCV2 Cap蛋白的重組PRV毒株的構(gòu)建29-39
• 2.1 材料與方法29-35
• 2.1.1 毒株、質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞、主要試劑及其溶液的配制29-30
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備30
• 2.1.3 PRV病毒的準(zhǔn)備30
• 2.1.4 PRV病毒基因組的提取30-31
• 2.1.5 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及鑒定31-32
• 2.1.6 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的提取32-33
• 2.1.7 轉(zhuǎn)染用細(xì)胞的準(zhǔn)備33
• 2.1.8 轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(TK)-EGFP和PRV基因組共轉(zhuǎn)染細(xì)胞33
• 2.1.9 TK基因缺失重組病毒的篩選、純化與鑒定33-34
• 2.1.10 rPRV-TK-/EGFP+重組毒株基因組的提取34
• 2.1.11 表達(dá)單個(gè)Cap蛋白重組病毒的篩選、純化與鑒定34-35
• 2.2 結(jié)果35-37
• 2.2.1 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建35
• 2.2.2 TK基因缺失重組病毒rPRV-TK-/EGFP+的獲得與鑒定35-36
• 2.2.3 表達(dá)單個(gè)Cap蛋白重組毒株的獲得與鑒定36-37
• 2.3 討論37-39
• 第三章 串聯(lián)表達(dá)2個(gè)PCV2 Cap蛋白的重組PRV毒株的構(gòu)建39-52
• 3.1 材料和方法40-44
• 3.1.1 試劑、質(zhì)粒和抗體40
• 3.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物40
• 3.1.3 rPRV-TK-/Cap+病毒基因組的提取40
• 3.1.4 轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(gE)的構(gòu)建與鑒定40-41
• 3.1.5 轉(zhuǎn)移載體pMD18T-LR(gE)-EGFP的構(gòu)建與鑒定41
• 3.1.6 含有Cap不同表達(dá)盒的轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建和鑒定41-42
• 3.1.7 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的提取42
• 3.1.8 轉(zhuǎn)染用細(xì)胞的準(zhǔn)備42
• 3.1.9 TK和gE基因缺失重組病毒的篩選、純化與鑒定42
• 3.1.10 rPRV-TK-/Cap+/gE-/EGFP+病毒基因組的提取42
• 3.1.11 含有Cap不同表達(dá)盒的重組病毒的篩選、純化與鑒定42-43
• 3.1.12 含有Cap不同表達(dá)盒的重組病毒的PCR與IPMA鑒定43-44
• 3.1.13 含有Cap不同表達(dá)盒的重組病毒的Western blot鑒定44
• 3.1.14 含有Cap不同表達(dá)盒的重組病毒的一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定44
• 3.1.15含有Cap不同表達(dá)盒的重組病毒在家兔上的安全性試驗(yàn)44
• 3.2 結(jié)果44-49
• 3.2.1 轉(zhuǎn)移載體的成功構(gòu)建44-45
• 3.2.2 TK和gE基因缺失重組毒株的篩選與鑒定45-46
• 3.2.3 含有Cap不同表達(dá)盒的重組毒株的篩選與鑒定46-48
• 3.2.4 含有Cap不同表達(dá)盒的重組毒株的Western blot鑒定48
• 3.2.5 含有Cap不同表達(dá)盒的重組毒株的生長(zhǎng)特性鑒定48-49
• 3.2.6 含有Cap不同表達(dá)盒的重組毒株對(duì)家兔的安全性試驗(yàn)49
• 3.3 討論49-52
• 第四章 PRV UL42蛋白抗原表位的鑒定52-62
• 4.1 材料和方法52-56
• 4.1.1 質(zhì)粒、試劑及抗體52-53
• 4.1.2 抗原表位的鑒定53-55
• 4.1.3 對(duì)抗原表位的分析55
• 4.1.4 單抗序列的測(cè)定55
• 4.1.5 UL42單克隆抗體的應(yīng)用55-56
• 4.2 結(jié)果56-60
• 4.2.1 UL42單克隆抗體特性的鑒定56-59
• 4.2.2 UL42單克隆抗體的應(yīng)用59-60
• 4.3 討論60-62
• 第五章 全文結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 致謝69-70
• 作者簡(jiǎn)歷70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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3 劉長(zhǎng)明;危艷武;陸月華;黃立平;吳洪麗;張朝霞;溫士剛;姜鳳娟;;豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(LG株)的研制與應(yīng)用[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2010年09期

4 田志軍;仇華吉;倪健強(qiáng);周艷君;蔡雪輝;周國(guó)輝;王云峰;童光志;;表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析(英文)[J];遺傳學(xué)報(bào);2005年12期

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本文編號(hào)：665406