發(fā)布時間：2017-08-12 22:29

  本文關(guān)鍵詞：馬紅球菌病血清學與病原學檢測方法的建立及其流行病學調(diào)查

  更多相關(guān)文章： 馬紅球菌 毒力相關(guān)脂蛋白A 間接ELISA 菌落印記 流行病學調(diào)查

【摘要】：馬紅球菌(Rhodococcus equi)是馬群聚居地常見的一種存在于土壤中的兼性細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性球桿菌,可導致馬駒亞急性或慢性化膿性支氣管肺炎和廣泛性肺部膿腫。馬紅球菌病致死率可達80%以上,可對馬場乃至馬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。到目前為止,我國R.equi的報導幾乎為零,缺乏標準的病原以及血清流行病學調(diào)查方法。最近報導,R.equi毒力相關(guān)脂蛋白A(VapA)是唯一的與細菌毒力相關(guān)的膜表面脂蛋白,可作為致病性R.equi的標志性抗原。因此,本研究通過構(gòu)建表達VapA重組蛋白(rVapA),建立了檢測致病性R.equi血清抗體的間接ELISA檢測方法以及檢測土壤中致病性與非致病性R.equi的菌落印記方法,并對我國馬群及馬聚居地R.equi進行了流行病學調(diào)查,為我國馬紅球菌病的防治提供技術(shù)支持、數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。首先,本研究選用pMAL-c5x原核表達體系,通過表達條件優(yōu)化,融合表達了可溶性rVapA,經(jīng)WB驗證,其具有良好的反應原性。其次,以純化的rVap A作為包被抗原,經(jīng)條件優(yōu)化,構(gòu)建了致病性R.equi血清抗體間接ELISA檢測方法,陽性臨界值為0.370。經(jīng)特異性、重復性及敏感性試驗,結(jié)果表明,其與H3N8馬流感、馬鼻肺炎、馬傳染性貧血抗血清無交叉反應,且批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于15%,具有較好的特異性、重復性和敏感性。采用該方法,首次對我國部分地區(qū)馬匹進行R.equi血清流行病學調(diào)查。結(jié)果表明,致病性R.equi血清抗體總體陽性率高達53.93%,且抗體水平呈顯著的地區(qū)性差異,存在品種、性別和季節(jié)特點,而與年齡無關(guān)。最后,本研究使用兔抗非致病性R.equi多抗以及兔抗致病性R.equi VapA蛋白多抗,并通過條件優(yōu)化,構(gòu)建了可用于R.equi檢測并區(qū)分致病性與非致病性R.equi的菌落印記檢測方法。與細菌分離鑒定及R.equi PCR鑒定方法相比,該檢測方法具有敏感性高、特異性好、檢測快速的優(yōu)點。采用該方法對我國部分地區(qū)馬場土壤中R.equi進行流行病學調(diào)查。結(jié)果表明,R.equi在馬場土壤中的分布與馬匹活動有關(guān),所有土壤樣本采集馬場均可分離鑒定出R.equi,土壤中R.equi的平均陽性率為43.21%,未發(fā)現(xiàn)致病性R.equi。本研究獲得融合表達rVapA蛋白,為R.equi致病機制研究提供材料基礎(chǔ),并為馬紅球菌病的診療方法的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究建立的間接ELISA檢測方法以及菌落印記檢測方法為馬紅球菌病流行病學調(diào)查提供技術(shù)支撐。本研究獲得的全國馬匹R.equi血清學及馬場R.equi流行病學信息,填補了我國R.equi流行情況空白的現(xiàn)狀,為我國R.equi的防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：馬紅球菌 毒力相關(guān)脂蛋白A 間接ELISA 菌落印記 流行病學調(diào)查
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.21
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 前言14-20
• 1 馬紅球菌病概述14-15
• 1.1 R. equi的流行概況14-15
• 1.2 馬紅球菌病的臨床癥狀及診斷15
• 1.3 馬紅球菌病的防治15
• 2 R. equi毒力相關(guān)蛋白研究概況15-18
• 2.1 致病性與非致病性R. equi的區(qū)別16
• 2.2 致病性R. equi毒力相關(guān)蛋白概述16-17
• 2.3 毒力相關(guān)蛋白Vap A的研究進展17-18
• 3 馬紅球菌病流行病學調(diào)查研究進展18-19
• 3.1 馬紅球菌病的病原學調(diào)查情況18
• 3.2 馬紅球菌病的血清學調(diào)查概況18-19
• 4 本研究的目的意義19-20
• 第一部分 馬紅球菌毒力相關(guān)蛋白Vap A的表達與純化20-39
• 1 材料20-23
• 1.1 菌種與質(zhì)粒20
• 1.2 主要試劑及耗材20
• 1.3 主要溶液的配置20-22
• 1.4 主要儀器及設(shè)備22-23
• 2 方法23-31
• 2.1 R. equi的復蘇與培養(yǎng)23
• 2.2 引物設(shè)計23-24
• 2.3 Vap A基因的PCR擴增與克隆24-28
• 2.3.1 Vap A基因的PCR擴增24
• 2.3.2 Vap A基因PCR產(chǎn)物的回收純化24-25
• 2.3.3 Vap A基因PCR產(chǎn)物與p Zero Back/blunt vector的連接25-26
• 2.3.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細胞26
• 2.3.5 可疑菌落的篩選26
• 2.3.6 重組質(zhì)粒p Zero Back-Vap A的提取26-27
• 2.3.7 重組質(zhì)粒p Zero Back-Vap A的雙酶切與測序鑒定27-28
• 2.4 原核表達重組質(zhì)粒p MAL-Vap A的構(gòu)建與鑒定28
• 2.5 可溶性重組蛋白r Vap A的表達及最佳誘導條件的確定28-29
• 2.5.1 IPTG誘導溫度的確定28-29
• 2.5.2 IPTG誘導時間的確定29
• 2.5.3 IPTG誘導濃度的確定29
• 2.6 重組蛋白r Vap A的SDS-PAGE分析29-30
• 2.7 可溶性重組蛋白r Vap A的非變性純化30-31
• 2.7.1 蛋白粗提30
• 2.7.2 r Vap A的親和層析30-31
• 2.8 重組蛋白r Vap A的抗原性分析31
• 3 結(jié)果31-36
• 3.1 Vap A基因的PCR擴增31-32
• 3.2 重組質(zhì)粒p Zero Back-Vap A的鑒定32-33
• 3.3 重組質(zhì)粒p MAL-Vap A的鑒定33
• 3.4 重組蛋白的表達條件優(yōu)化33-36
• 3.4.1 重組蛋白的誘導表達以及最佳IPTG誘導溫度的確定33-34
• 3.4.2 最佳IPTG誘導濃度與時間的確定34-35
• 3.4.3 重組蛋白的純化35-36
• 3.5 重組蛋白r Vap A的抗原性分析36
• 4 討論36-38
• 4.1 重組蛋白r Vap A中MBP的作用37
• 4.2 重組蛋白r Vap A的誘導表達與純化37-38
• 5 結(jié)論38-39
• 第二部分 馬紅球菌病抗體間接ELISA檢測方法的建立及其血清流行病學調(diào)查39-57
• 1 材料39
• 1.1 參比血清及主要試劑材料39
• 1.2 主要溶液的配制39
• 2 方法39-42
• 2.1 抗原包被濃度及血清最佳稀釋度的確定40
• 2.2 酶標二抗最佳工作濃度的確定40
• 2.3 封閉液的選擇40
• 2.4 ELISA臨界值的確定40
• 2.5 重復性試驗40
• 2.6 特異性試驗40-41
• 2.7 R. equi血清流行病學調(diào)查41-42
• 2.7.1 馬血清樣本的采集41
• 2.7.2 馬血清樣本的檢測41
• 2.7.3 統(tǒng)計學分析41-42
• 3 結(jié)果42-53
• 3.1 抗原包被濃度及血清最佳稀釋度的確定42-43
• 3.2 酶標二抗最佳工作濃度的確定43-44
• 3.3 封閉液的選擇44
• 3.4 ELISA臨界值的確定44-45
• 3.5 重復性試驗45
• 3.6 特異性試驗45-46
• 3.7 R. equi血清流行病學調(diào)查46-53
• 3.7.1 馬匹致病性R. equi血清抗體陽性率46-48
• 3.7.2 致病性R. equi血清抗體水平的地區(qū)差異48-49
• 3.7.3 馬匹致病性R. equi血清抗體水平的種間差異49-50
• 3.7.4 馬匹致病性R. equi血清抗體水平的性別差異50-51
• 3.7.5 致病性R. equi血清抗體水平的季節(jié)差異51-52
• 3.7.6 致病性R. equi血清抗體水平與馬匹年齡的相關(guān)性分析52-53
• 4 討論53-56
• 4.1 R. equi間接ELISA檢測方法的建立53-54
• 4.2 血清流行病學調(diào)查54-56
• 4.2.1 我國致病性R. equi血清抗體陽性率與世界各地區(qū)的比較54
• 4.2.2 我國地區(qū)間致病性R. equi血清抗體水平差異的分析54-55
• 4.2.3 我國馬匹致病性R. equi血清抗體水平的季節(jié)特點55
• 4.2.4 我國馬匹致病性R. equi血清抗體水平的性別特點55-56
• 4.2.5 我國馬匹致病性R. equi血清抗體水平的品種特點56
• 4.2.6 我國馬匹致病性R. equi血清抗體水平的年齡特點56
• 5 結(jié)論56-57
• 第三部分 馬紅球菌菌落印記檢測方法的建立及其病原流行病學調(diào)查57-77
• 1 材料57-58
• 1.1 菌株及主要試劑材料57
• 1.2 實驗動物57
• 1.3 引物57
• 1.4 主要溶液的配制57-58
• 2 方法58-64
• 2.1 R. equi的常規(guī)分離與細菌生化鑒定58-59
• 2.2 R. equi的PCR鑒定59
• 2.3 16S r RNA測序鑒定59
• 2.4 R. equi菌落印記檢測方法的建立59-62
• 2.4.1 多克隆抗體的制備59-60
• 2.4.2 陽性樣本的處理及細菌培養(yǎng)60
• 2.4.3 菌落印記法反應條件的優(yōu)化60-61
• 2.4.4 特異性檢測61-62
• 2.4.5 靈敏度檢測62
• 2.5 R. equi流行病學調(diào)查62-64
• 2.5.1 土壤樣本的采集62-63
• 2.5.2 土壤樣本的分離鑒定63-64
• 2.5.3 馬匹各活動區(qū)域R. equi分布情況分析64
• 3 結(jié)果64-73
• 3.1 致病性與非致病性R. equi的培養(yǎng)特性及生化特征64
• 3.2 R. equi的PCR鑒定64-65
• 3.3 土壤選擇性培養(yǎng)分離菌株的 16S r RNA測序鑒定65
• 3.4 R. equi菌落印記檢測方法的建立65-69
• 3.4.1 多克隆抗體的制備65-66
• 3.4.2 菌落印記法反應條件的優(yōu)化66-67
• 3.4.3 菌落印記法檢測鑒定標準的確定67-68
• 3.4.4 特異性檢測68-69
• 3.5 R. equi的PCR鑒定法與菌落印記法的靈敏度比較69-70
• 3.6 R. equi病原流行病學調(diào)查70-73
• 3.6.1 R. equi PCR鑒定法70-71
• 3.6.2 R. equi菌落印記檢測方法71
• 3.6.3 R. equi PCR鑒定法與菌落印記法的比較71-72
• 3.6.4 馬場各活動區(qū)域土壤R. equi分布情況分析72-73
• 4 討論73-76
• 4.1 常規(guī)R. equi分離鑒定、16S r RNA測序鑒定以及PCR鑒定73-74
• 4.2 R. equi菌落印記檢測方法74
• 4.3 R. equi流行病學調(diào)查74-75
• 4.4 R. equi病原學與血清學調(diào)查結(jié)果比對75-76
• 5 結(jié)論76-77
• 全文總結(jié)77-78
• 致謝78-79
• 參考文獻79-85
• 附錄I 碩士期間研究成果85-86
• 附錄II 16SrRNA測序鑒定菌株86-90

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 龔鳳平;孫凌霜;魚海瓊;林志雄;李守軍;;馬紅球菌VapA蛋白的表達及其間接ELISA檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2016年03期

2 蒙志好;蘇凌松;;馬紅球菌病研究進展[J];內(nèi)科;2009年03期

3 丁壯;Shinji TAKAI;Hiroo MADARAME;常爽;黃海楠;霍曉偉;高明華;譚忠田;高雙成;Fumiko HATORI;Yukako SASAKI;Tsutomu KAKUDA;Shiro TSUBAKI;;中國內(nèi)蒙自治區(qū)馬飼育環(huán)境土壤中馬紅球菌的分布(英文)[J];中國獸醫(yī)學報;2008年01期

4 劉文強;賈玉萍;趙宏坤;;16 S rRNA在細菌分類鑒定研究中的應用[J];動物醫(yī)學進展;2006年11期

，

本文編號：663991