本文關(guān)鍵詞：豬雄性生殖干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系的建立

  更多相關(guān)文章： 豬 雄性生殖干細(xì)胞 分離與純化 體外培養(yǎng)

【摘要】：雄性生殖干細(xì)胞是位于曲精細(xì)管內(nèi)的特殊的成體干細(xì)胞類群,具有自我更新維持群體數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡以及分化進(jìn)入精子發(fā)生的能力,在干細(xì)胞生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作及男性不育治療等領(lǐng)域具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。雄性生殖干細(xì)胞數(shù)量極為稀少,且占睪丸總細(xì)胞比率極低,嚴(yán)重限制了相關(guān)研究進(jìn)展。因而純化及體外擴(kuò)增雄性生殖干細(xì)胞,將有望為后續(xù)研究提供源源不斷的研究材料。本研究旨在利用細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法優(yōu)化豬雄性生殖干細(xì)胞富集方案,并探究血清替代物、生長(zhǎng)因子組合等在其體外培養(yǎng)的影響,優(yōu)化豬雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件,成功建立體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系,為豬雄性生殖干細(xì)胞后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。本研究主要研究結(jié)果如下:1、優(yōu)化差異貼壁方案對(duì)豬雄性生殖干細(xì)胞進(jìn)行富集。分別對(duì)富集前后細(xì)胞進(jìn)行PLZF、GFRA1和UCHL1免疫細(xì)胞熒光染色,結(jié)果顯示富集后生殖干細(xì)胞純度由富集前的10.50±0.13%提高至72.66±2.96%,顯著優(yōu)于傳統(tǒng)差異貼壁方案28.71±1.00%。2、探究血清替代物(Konckout serum replacement,KSR)對(duì)豬雄性生殖干細(xì)胞體外增殖的作用。結(jié)果表明,在血清濃度1%條件下添加血清替代物KSR(10%),與對(duì)照組相比可以顯著提高pMGSCs體外增殖能力。3、探究不同生長(zhǎng)因子組合對(duì)豬雄性生殖干細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響,結(jié)果顯示GDNF、bFGF、IgF1均能不同程度促進(jìn)生殖干細(xì)胞克隆形成與擴(kuò)張。其中GDNF(10ng/mL)、GFRA1(20ng/mL)和bFGF(10ng/mL)聯(lián)合添加效果最佳。4、在本試驗(yàn)篩選的條件下,完成豬雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)2月,傳代10次;細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR和western-blot證實(shí)培養(yǎng)后細(xì)胞仍表達(dá)雄性生殖干細(xì)胞分子標(biāo)記UCHL1、PLZF、GFRA1等;核型分析顯示染色體條數(shù)正常;將培養(yǎng)近2月豬雄性生殖干細(xì)胞移植到白消安處理的小鼠曲精細(xì)管,四周后仍可觀察到紅色熒光標(biāo)記的豬雄性生殖干細(xì)胞定植于小鼠曲精細(xì)管基底膜并形成克隆。以上表明本試驗(yàn)成功建立了豬雄性生殖干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系。該培養(yǎng)體系的建立將為豬雄性生殖干細(xì)胞增殖與分化機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ),并為其他大家畜雄性生殖干細(xì)胞的研究提供參考依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：豬 雄性生殖干細(xì)胞 分離與純化 體外培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1.1 雄性生殖干細(xì)胞簡(jiǎn)介11
• 1.2 雄性生殖干細(xì)胞特性及其微環(huán)境11-14
• 1.3 雄性生殖干細(xì)胞的分離、富集與分子標(biāo)記14-18
• 1.3.1 雄性生殖干細(xì)胞的分離14
• 1.3.2 雄性生殖干細(xì)胞的富集14-15
• 1.3.3 雄性生殖干細(xì)胞的分子標(biāo)記15-16
• 1.3.4 雄性生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)及其關(guān)鍵信號(hào)通路16-18
• 1.4 雄性生殖干細(xì)胞的移植18-20
• 1.4.1 雄性生殖干細(xì)胞移植技術(shù)18
• 1.4.2 精原干細(xì)胞移植受體的制備18-20
• 第二章 豬雄性生殖干細(xì)胞的分離純化20-24
• 2.1 材料和方法20-21
• 2.1.1 材料20
• 2.1.2 主要試劑20
• 2.1.3 方法20-21
• 2.2 結(jié)果21-22
• 2.3 討論22-23
• 2.4 小結(jié)23-24
• 第三章 不同添加物對(duì)豬雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響24-29
• 3.1 材料和方法24-25
• 3.1.1 材料24
• 3.1.2 主要試劑24
• 3.1.3 方法24-25
• 3.2 結(jié)果25-27
• 3.2.1 血清替代物在豬雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響25-26
• 3.2.2 不同濃度生長(zhǎng)因子對(duì)豬雄性生殖干細(xì)胞增殖的影響26-27
• 3.3 討論27-28
• 3.4 小結(jié)28-29
• 第四章 豬雄性生殖干細(xì)胞培養(yǎng)后鑒定29-35
• 4.1 材料和方法29-31
• 4.1.1 材料29
• 4.1.2 主要試劑29
• 4.1.3 方法29-31
• 4.2 結(jié)果31-34
• 4.2.1 豬雄性生殖干細(xì)胞克隆免疫細(xì)胞熒光染色31-32
• 4.2.2 豬雄性生殖干細(xì)胞RT-PCR、western-blot檢驗(yàn)及核型分析32-33
• 4.2.3 豬雄性生殖干細(xì)胞的異種移植33-34
• 4.3 討論34
• 4.4 小結(jié)34-35
• 第五章 結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)35-36
• 參考文獻(xiàn)36-41
• 附錄41-43
• 致謝43-44
• 作者簡(jiǎn)介44

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1 記者 鄭穎t牎∥飧，

本文編號(hào)：658144