本文關(guān)鍵詞：牛GHR基因與miR-139靶向關(guān)系的驗證

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【摘要】：旨在構(gòu)建牛生長激素受體(Growth hormone receptor,GHR)基因3′非翻譯區(qū)(Untranslated region,UTR)雙熒光素酶載體,并確定miR-139與牛GHR基因的靶向關(guān)系。本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-139與牛GHR基因3′UTR的結(jié)合位點;人工合成牛GHR基因3′UTR及突變型片段并克隆至雙熒光素酶載體psiCHECK-2上,構(gòu)建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3′UTR)及突變型(psiCHECK2-GHR-M 3′UTR)雙熒光素酶報告質(zhì)粒。將培養(yǎng)的Hela細(xì)胞分為4組,分別共轉(zhuǎn)染miR-139mimic或陰性對照和psiCHECK2-GHR-W 3′UTR重組質(zhì)�；騪siCHECK2-GHR-M 3′UTR重組質(zhì)粒,然后用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測4組細(xì)胞中熒光素酶活性。之后培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞,分別設(shè)對照組、陰性對照組、miR-139 mimic及miR-139inhibitor組,對陰性對照組、miR-139mimic組及miR-139inhibitor組分別轉(zhuǎn)染陰性對照、miR-139mimic或miR-139inhibitor,利用qPCR(Realtime quantitative PCR)進一步檢測各組miR-139及GHR基因的mRNA表達。結(jié)果,通過雙酶切試驗證實成功構(gòu)建了野生型及突變型重組雙熒光素酶報告質(zhì)粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和psiCHECK2-GHR-M 3′UTR;當(dāng)野生型重組質(zhì)粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和miR-139mimic共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,雙熒光素酶報告質(zhì)粒表達的熒光素酶活性顯著低于其他處理組(P0.05)。qPCR進一步證實miR-139能顯著下調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中GHR基因mRNA的表達(P0.05)。本研究成功構(gòu)建了牛野生型及突變型GHR基因3′UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒;雙熒光素酶試驗及qPCR證實miR-139與牛GHR基因3′UTR存在靶向關(guān)系。
【作者單位】： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;
【關(guān)鍵詞】： 牛 生長激素受體 ′非翻譯區(qū) miR-
【基金】：國家自然基金青年基金(31401093) 留學(xué)回國人員科研啟動基金 黑龍江省教育廳科研項目(12541018)
【分類號】：S823
【正文快照】： microRNAs(miRNAs)是約22個核苷酸、進化上保守、內(nèi)源性非編碼的RNA,以序列特異性的方式結(jié)合至靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′UTR),可在轉(zhuǎn)錄后通過抑制轉(zhuǎn)錄或下調(diào)mRNA表達來調(diào)節(jié)基因表達[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)每個miRNA可調(diào)節(jié)約200個mRNA,每個mRNA有多重潛在靶基因位點與miRNA結(jié)合[3-4]。

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