本文關(guān)鍵詞：一種提高禽流感滅活疫苗異源保護(hù)力的輔助制劑研究

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【摘要】：H5N1高致病性禽流感病毒(H5N1 highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)嚴(yán)重危害禽類養(yǎng)殖業(yè)以及人類健康。疫苗接種是防控禽流感的有效策略,當(dāng)前使用的全病毒滅活苗主要通過血凝素蛋白(HA)誘導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生,而HA變異頻繁,造成疫苗對異源毒株的保護(hù)力不足。過去幾年,中國政府陸續(xù)推出了一系列來自H5 HA不同進(jìn)化分支的滅活疫苗來控制H5N1禽流感病毒,但始終不能跟上病毒變異的節(jié)奏。因此,亟需一種提高禽流感滅活疫苗異源保護(hù)力的輔助制劑,彌補(bǔ)禽流感滅活疫苗對異源毒株保護(hù)力不足的缺陷。研究已證實(shí)流感病毒多個(gè)保守B、T淋巴細(xì)胞表位的結(jié)合能夠同時(shí)刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究表明H5N1 AIV血凝素莖區(qū)(HA2)76-130位氨基酸高度保守,人工合成的HA2 76-130多肽免疫小鼠后能夠?qū)Χ鄠�(gè)亞型流感病毒的攻擊提供保護(hù)。A型流感病毒基質(zhì)蛋白M2胞外區(qū)(M2e),同樣也是高度保守的抗原,已經(jīng)被廣泛用于通用疫苗的研究。此外,核蛋白(nucleoprotein,NP)第55-69和380-393位氨基酸能夠分別刺激輔助型T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞,對流感病毒的交叉保護(hù)具有重要作用。盡管表位疫苗能夠引起廣泛的免疫反應(yīng),單獨(dú)依靠抗原表位難以抵抗H5N1 HPAIV的攻擊,基于以上原因,將表位抗原作為一種輔助制劑,與H5N1滅活苗聯(lián)合使用,也許是一種可行的策略。本研究選取了H5N1 AIV 4個(gè)高度保守的抗原表位包括HA2 76-130、3M2e、NP55-69以及NP380-393(HMNN)。含柔性連接序列(linker)的基因片段HMNN由公司合成,克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast Bac-VSV-G多角體蛋白啟動(dòng)子下游獲得p Fast-G-HMNN。按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作手冊獲得重組桿狀病毒BV-HMNN。為了評價(jià)重組桿狀病毒與滅活苗聯(lián)合使用對異源H5N1病毒的保護(hù)效力,本研究以SPF雞作為動(dòng)物模型,肌肉注射免疫0.1 mL(1010 pfu/mL)BV-HMNN和0.3 mL對應(yīng)2.3.2.1分支的Re-6滅活苗(Re-6+BV-HMNN),同時(shí)設(shè)桿狀病毒野毒與Re-6滅活苗聯(lián)合免疫組(Re-6+BV-WT)、Re-6滅活苗單獨(dú)免疫組(Re-6)以及PBS對照組(Mock)。單次免疫后3周,用2.3.4.4分支的禽流感病毒A/goose/guangdong/14079/2013(GD/14079,H5N1)進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)與Re-6滅活苗聯(lián)合免疫時(shí),BV-HMNN不會(huì)影響滅活苗的HI效價(jià)卻能顯著增加M2e特異性IgG抗體滴度。在應(yīng)對致死劑量的異源GD/14079病毒攻擊時(shí),Re-6+BV-HMNN免疫組保護(hù)率為100%,而Re-6免疫組僅獲得了50%的保護(hù)。在排毒檢測方面,Re-6+BV-HMNN組在攻毒后3、5、7天都沒有從口咽和泄殖腔拭子中分離到病毒,而Re-6組在攻毒后第5天檢測到1只雞排毒,攻毒后第7天檢測到3只雞排毒。PBS對照組在攻毒后第3天檢測到排毒,第5天達(dá)排毒高峰,第7天全部死亡。Re-6+BV-WT免疫組的保護(hù)效果也優(yōu)于Re-6單獨(dú)免疫組,主要表現(xiàn)為雞的存活率更高、拭子的病毒滴度更低。綜上所述,將重組桿狀病毒BV-HMNN作為一種輔助制劑,與H5N1滅活苗聯(lián)合使用,能夠增強(qiáng)滅活苗的異源保護(hù)力,在應(yīng)對H5N1禽流感病毒的變異以及流感大流行方面具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：禽流感 H5N1 滅活苗 表位 桿狀病毒 輔助制劑
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S859.79
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文縮略詞8-12
• 1 前言12-23
• 1.1 流感病毒12-14
• 1.1.1 H5N1高致病性禽流感流行現(xiàn)狀12-13
• 1.1.2 禽流感病毒分子生物學(xué)13-14
• 1.2 禽流感疫苗的研究進(jìn)展14-19
• 1.2.1 全病毒滅活疫苗14-15
• 1.2.2 DNA疫苗15
• 1.2.3 重組活載體疫苗15-16
• 1.2.4 基因工程亞單位疫苗16
• 1.2.5 通用型流感疫苗16-19
• 1.3 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)19-22
• 1.3.1 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)概述19-21
• 1.3.2 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在禽流感疫苗研究中的應(yīng)用21-22
• 1.4 研究目的和意義22-23
• 2 材料與方法23-37
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 病毒23
• 2.1.2 細(xì)胞23
• 2.1.3 菌種與質(zhì)粒23
• 2.1.4 抗體23
• 2.1.5 主要試劑23-24
• 2.1.6 細(xì)胞培養(yǎng)試劑配制24
• 2.1.7 細(xì)菌培養(yǎng)試劑配制24
• 2.1.8 抗生素配制24-25
• 2.1.9 質(zhì)粒提取相關(guān)試劑25
• 2.1.10 其它試劑配制25-26
• 2.1.11 主要儀器和設(shè)備26
• 2.2 方法26-37
• 2.2.1 重組質(zhì)粒pc DNA3.1-HMNN的構(gòu)建與鑒定26-29
• 2.2.2 重組質(zhì)粒p Fast-G-CMV-HMNN的構(gòu)建與鑒定29-31
• 2.2.3 三抗高鹽LB瓊脂培養(yǎng)平板的制備31
• 2.2.4 重組桿狀病毒BV-HMNN的獲得31-33
• 2.2.5 重組桿狀病毒BV-HMNN的鑒定33-34
• 2.2.6 重組桿狀病毒的純化與毒價(jià)測定34
• 2.2.7 免疫原性分析以及攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)34-37
• 3 結(jié)果與分析37-45
• 3.1 抗原表位氨基酸序列37
• 3.2 重組質(zhì)粒pc DNA3.1-HMNN的鑒定37-38
• 3.3 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p Fast-G-CMV-HMNN的鑒定38-39
• 3.4 重組穿梭載體Bacmid-G-HMNN的鑒定39-40
• 3.5 重組桿狀病毒BV-HMNN的獲得40
• 3.6 重組桿狀病毒結(jié)構(gòu)示意圖40
• 3.7 重組桿狀病毒BV-HMNN轉(zhuǎn)導(dǎo)CEF細(xì)胞40-41
• 3.8 HI抗體和M2e抗體檢測41-42
• 3.9 保護(hù)率42-43
• 3.10 排毒情況43-45
• 4 討論與結(jié)論45-48
• 全文總結(jié)48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 附錄A pc DNA3.1 (+) 表達(dá)載體圖譜56-57
• 附錄B p Fast Bac~(TM) Dual表達(dá)載體圖譜57-58
• 附錄C 碩士期間發(fā)表文章58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號：640326