本文關鍵詞：AIV鑒定、擴增及測序引物的優(yōu)化和應用及H9N2亞型AIV對哺乳動物潛在危害的分子基礎研究

  更多相關文章： 禽流感病毒 引物的優(yōu)化和應用 鼠致病性 繼代感染 致病機理

【摘要】：亞型鑒定是禽流感病毒研究的一項基礎而重要的工作。由于禽流感病毒的不斷進化,給禽流感病毒的診斷工作帶來了新的問題。目前常用的亞型鑒定方法是RT-PCR反應,而引物決定RT-PCR反應的特異性和靈敏性。為適應禽流感病毒的變異,RT-PCR反應中使用的引物需要不斷的更新。因H5、H7、H9、H3、H4和H6,N1、N2、N6、N8及N9為目前流感病毒的優(yōu)勢亞型,根據(jù)本實驗室已有的及GeneBank中的序列,進行比對,使用Primer5軟件設計這些亞型的HA和NA的通用擴增引物及特異性的鑒定引物。禽流感病毒的內(nèi)部基因相對比較保守,下載各亞型禽流感病毒的六個內(nèi)部基因序列,比對后,設計通用引物。在測序方面,采用一對M13F/M13R引物替代之前的分節(jié)段測序引物。采用優(yōu)化的引物對2013-2015年邊境省份的禽流感流行病學調(diào)查中分離到的41株禽流感病毒進行了亞型鑒定和序列測定。包括5株H5N6亞型、2株H5N1亞型、10株H3N2亞型及24株H9N2亞型。對41株病毒株進行全基因組測序分析發(fā)現(xiàn):5株H5N6亞型禽流感病毒集中于clade2.3.4.4分支;2株H5N1亞型禽流感病毒屬于clade2.3.2.1c分支;10株H3N2亞型禽流感病毒均處于歐亞禽源病毒分支;24株H9N2亞型禽流感病毒都分布在BJ/1/94亞群。關鍵氨基酸位點分析發(fā)現(xiàn):所有H5亞型病毒HA蛋白裂解位點均有多個連續(xù)的堿性氨基酸,符合HPAIV的特征;所有H3和H9亞型病毒HA蛋白裂解位點均不含有多個連續(xù)的堿性氨基酸,符合LPAIV的特征。同源性分析發(fā)現(xiàn):2株從虎體內(nèi)分離到的H5N1亞型禽流感病毒為重組病毒,其內(nèi)部基因由H9N2亞型禽流感病毒提供。H9N2禽流感病毒為感染人的流感病毒,如1997年的香港H5N1禽流感病毒、2013年的H7N9及H10N8禽流感病毒,這些新型重組病毒提供了內(nèi)部基因片段,并在新型禽流感病毒的產(chǎn)生中起重要作用。H9N2亞型禽流感病毒在我國流行甚廣,本實驗室近年來從哺乳動物體內(nèi)分離到了多株H9N2亞型禽流感病毒。為探究H9N2亞型禽流感病毒對哺乳動物的致病機制,選取Civet/GX/S9/13(H9N2)病毒株在小鼠上進行了致病性和適應性研究。原代Civet/GX/S9/13(H9N2)僅在BALB/C鼠的肺臟和鼻甲骨中呈較低程度的復制,對小鼠不致死,呈低致病性。將該病毒在BALB/C鼠體內(nèi)繼代感染,其在小鼠的肺臟和鼻甲骨中復制滴度增高,第8代病毒致死BALB/C鼠,對BALB/C鼠的致病性增強。分析繼代感染病毒的氨基酸位點,發(fā)現(xiàn)只有PB2蛋白上有三個氨基酸位點發(fā)生了突變。在上述研究的基礎上,以Civet/GX/S9/13(H9N2)為模式病毒,利用反向遺傳技術(shù)開展了H9N2亞型禽流感病毒對哺乳動物致病性差異的分子機制研究。建立了模式病毒的反向遺傳操作系統(tǒng),通過雞胚感染和小鼠感染實驗證實了救獲的親本病毒保持了野生型病毒原有的生物學特性。
【關鍵詞】：禽流感病毒 引物的優(yōu)化和應用 鼠致病性 繼代感染 致病機理
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 禽流感病毒簡介12-13
• 1.2 禽流感病毒的流行及公共衛(wèi)生學意義13
• 1.3 禽流感病毒致病性的分子基礎13-17
• 1.3.1 HA14
• 1.3.2 NA14-15
• 1.3.3 PB215-16
• 1.3.4 PB1-F216
• 1.3.5 NS116-17
• 1.4 禽流感病毒的變異17-19
• 1.4.1 禽流感病毒的變異機制17
• 1.4.2 H5N1亞型禽流感病毒的變異17-18
• 1.4.3 H9N2亞型禽流感病毒的變異18
• 1.4.4 H7亞型禽流感病毒的變異18-19
• 1.5 禽流感病毒的檢測19
• 1.5.1 禽流感病毒的檢測方法19
• 1.5.2 禽流感病毒的引物19
• 1.6 反向遺傳操作技術(shù)19-20
• 1.7 本研究的目的意義20-21
• 第二章 AIV分子診斷引物的優(yōu)化21-26
• 2.1 材料21
• 2.1.1 實驗用軟件21
• 2.1.2 實驗用毒株21
• 2.1.3 實驗用試劑21
• 2.2 方法21-22
• 2.2.1 參考序列21
• 2.2.2 引物設計21
• 2.2.3 RT-PCR擴增21-22
• 2.3 結(jié)果22-25
• 2.3.1 鑒定引物的優(yōu)化22-23
• 2.3.2 HA基因擴增引物的優(yōu)化23
• 2.3.3 NA基因擴增引物的優(yōu)化23-24
• 2.3.4 內(nèi)部基因擴增引物的優(yōu)化24-25
• 2.3.5 測序引物的優(yōu)化25
• 2.4 討論25-26
• 第三章 AIV分子診斷引物的應用26-55
• 3.1 材料26
• 3.1.1 樣品26
• 3.1.2 實驗用雞胚26
• 3.1.3 主要試劑及儀器26
• 3.1.4 引物與參考序列26
• 3.2 方法26-29
• 3.2.1 病毒RNA的提取26-27
• 3.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA27
• 3.2.3 聚合酶鏈式反應（PCR）擴增病毒各節(jié)段27
• 3.2.4 PCR產(chǎn)物的鑒定與純化27-28
• 3.2.5 各節(jié)段的核酸序列測定28-29
• 3.2.6 各節(jié)段序列的拼接和進化樹構(gòu)建29
• 3.3 結(jié)果29-53
• 3.3.1 病毒分離及亞型鑒定29-30
• 3.3.2 HA基因的遺傳演化分析30-38
• 3.3.3 NA基因的遺傳演化分析38-43
• 3.3.4 內(nèi)部基因的遺傳演化分析43-53
• 3.4 討論53-55
• 第四章 H9N2 AIV對哺乳動物致病機理研究55-64
• 4.1 材料55-56
• 4.1.1 病毒株55
• 4.1.2 SPF雞胚及試驗動物55
• 4.1.3 試劑55
• 4.1.4 生物安全性55
• 4.1.5 引物55
• 4.1.6 PBD質(zhì)粒載體55-56
• 4.2 方法56-58
• 4.2.1 雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定56
• 4.2.2 H9N2亞型禽流感原代病毒對BALB/c鼠的致病性試驗56-57
• 4.2.3 H9N2亞型禽流感病毒在BALB/c鼠體內(nèi)繼代感染57
• 4.2.4 H9N2亞型禽流感病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建57-58
• 4.2.5 H9N2亞型禽流感病毒拯救及救獲病毒的鑒定58
• 4.3 結(jié)果58-62
• 4.3.1 同源性比較58-59
• 4.3.2 H9N2 亞型禽流感病毒原代病毒對 BALB/c 鼠的致病性試驗結(jié)果59-60
• 4.3.3 H9N2 亞型禽流感病毒在 BALB/c 鼠體內(nèi)繼代感染結(jié)果60-62
• 4.3.4 H9N2 亞型禽流感病毒在 BALB/c 鼠體內(nèi)繼代感染之后氨基酸差異62
• 4.3.5 H9N2 禽流感病毒拯救及鑒定結(jié)果62
• 4.4 討論62-64
• 全文結(jié)論64-65
• 參考文獻65-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周鴻飛;禽流感病毒真面目[J];光明中醫(yī);2004年01期

2 ;禽流感病毒分布有明顯的地域性相關[J];山東家禽;2004年03期

3 洪水根;各國通力合作 圍剿禽流感[J];廈門科技;2004年01期

4 徐瑛;珍愛生命、關注社會、抗擊禽流感——7年級生物學課堂實錄[J];生物學通報;2004年04期

5 ;低溫下的禽流感病毒能存活更長時間[J];飼料與畜牧;2004年06期

6 魏秀儉,李曉鵬;禽流感病毒概述[J];聊城大學學報(自然科學版);2004年03期

7 ;科學與禽流感之間的戰(zhàn)爭[J];科技資訊;2004年05期

8 ;我國禽流感病毒研究新發(fā)現(xiàn)[J];中國牧業(yè)通訊;2005年19期

9 范宗理;鴨子可擴大禽流感病毒傳播的危險性[J];自然雜志;2005年03期

10 然悠;直面禽流感[J];蘇南科技開發(fā);2005年11期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫曉林;;禽流感和公共衛(wèi)生[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分第12次暨中國動物病理生理學專業(yè)委員會第11次學術(shù)討論會論文集[C];2003年

2 何義林;葉冬青;;禽流感病毒對人類感染機制的研究進展[A];第二屆全國人畜共患病學術(shù)研討會論文集[C];2008年

3 春陽;李東;;再論“以科學發(fā)展觀應對禽流感事件”——評禽流感病毒變種兩次恐慌論[A];首屆中國黃羽肉雞行業(yè)發(fā)展大會會刊[C];2008年

4 鄧潔麗;段明星;俞初一;江龍;;聚聯(lián)乙炔有序組裝體在識別禽流感病毒方面的應用研究[A];中國化學會第十二屆膠體與界面化學會議論文摘要集[C];2009年

5 孫恩澤;謝敏;趙海粟;黃碧海;劉書琳;張萬坡;張志凌;王漢中;龐代文;;量子點標記禽流感病毒[A];第六屆全國化學生物學學術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

6 黃志堅;陳強;李清祿;王壽昆;江和基;;不同消毒劑對禽流感病毒的殺滅試驗[A];福建省科協(xié)第八屆學術(shù)年會分會場“轉(zhuǎn)變飼養(yǎng)方式，促進海西畜牧業(yè)和諧發(fā)展”學術(shù)年會論文集[C];2008年

7 周祖華;張敏;程禮明;徐彬;沈彩信;;禽流感流行趨勢分析[A];全國人畜共患病學術(shù)研討會論文集[C];2006年

8 王志宇;張議文;劉桂林;;禽流感病毒的分子生物學研究進展[A];全國動物生理生化第十一次學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2010年

9 劉迎芳;饒子和;;禽流感病毒(H5N1)RNA聚合酶PA亞基相關三維晶體結(jié)構(gòu)與功能分析[A];第十一次中國生物物理學術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

10 韋婷;胡杰;蘭彬;陸文俊;蘇凱;覃芳蕓;;廣西暴發(fā)中低毒力禽流感情況報告[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學會分會第十次學術(shù)研討會論文集[C];2000年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與流行病學中心主任 崔尚金 博士;候鳥發(fā)生禽流感給我們的警示[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2005年

2 莫書瑩;世衛(wèi)警告：禽流感或大流行全球經(jīng)濟應警惕[N];第一財經(jīng)日報;2005年

3 本報記者 魏紅欣;禽流感“啄”痛全球經(jīng)濟[N];國際金融報;2005年

4 本報記者　許凱;狙擊禽流感：一場鳥與人的戰(zhàn)爭[N];國際金融報;2005年

5 新華社記者　楊愛國;防控禽流感需要加強國際合作[N];光明日報;2005年

6 李楊;禽流感疫情不會長期影響農(nóng)產(chǎn)品期價[N];金融時報;2005年

7 羅政、夏文輝;香港強化防止禽流感措施[N];人民日報海外版;2004年

8 本報記者　張向永　趙秀芹;禽流感讓全世界手牽手[N];市場報;2005年

9 ;禽流感病毒能否絕跡？[N];中國石油報;2004年

10 何源;嚴防禽流感從境外傳入我國[N];中國食品質(zhì)量報;2005年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄒鎮(zhèn);H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸損傷的機理研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2012年

2 趙蔚;基于磁分離和熒光量子點標記的高靈敏禽流感病毒檢測[D];武漢大學;2012年

3 區(qū)嘉賢;H7N9禽流感患者的臨床特征及預后分析[D];復旦大學;2014年

4 劉三紅;禽流感的數(shù)學建模及數(shù)值模擬[D];華中師范大學;2015年

5 樊兆斌;野鳥源禽流感病毒(AIV)分離株的遺傳進化及其致病性研究[D];東北林業(yè)大學;2014年

6 桑曉宇;H9N2亞型禽流感病毒在豚鼠模型中水平傳播的分子機制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

7 楊文濤;靶向樹突狀細胞通用型禽流感病毒重組乳酸菌的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 石霖;北方某省主要亞型禽流感現(xiàn)地調(diào)查分析及RT-LAMP檢測方法研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2015年

9 張曉劍;HA蛋白糖基化修飾對H5N1亞型禽流感病毒復制、致病性和抗原性的影響[D];揚州大學;2014年

10 朱聞斐;H7N9禽流感病毒致病與傳播機制研究[D];中國疾病預防控制中心;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高曉龍;2014年度中國東部候鳥禽流感病毒分離與鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

2 徐曉龍;H5和H7亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

3 韓苗苗;一類人畜共患的禽流感傳染病傳播模型[D];大連理工大學;2015年

4 王秋珍;H9N2禽流感病毒NS1蛋白誘導的氧化應激促進DF-1細胞凋亡[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

5 梁威;5株H9N2亞型AIV血凝素結(jié)構(gòu)分析及感染A549細胞的蛋白質(zhì)組學研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2015年

6 劉媛媛;MDCK細胞表達雞ST3GAL I基因?qū)9亞型禽流感病毒增殖情況的影響[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2013年

7 孟芳;H9N2亞型禽流感HA基因演化及其內(nèi)部基因在H5N2亞型流感病毒演化中的作用[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 韓雯;山東地區(qū)H9N2禽流感流行病學調(diào)查及流行毒株分子生物學檢測[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2014年

9 查國飛;昆蟲細胞表達重組H5亞型禽流感HA蛋白及其免疫原性研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2014年

10 侯群;新疆青格達湖濕地鳥類中H5、H7亞型AIV和NDV流行病學監(jiān)測[D];石河子大學;2015年

，

本文編號：631387