發(fā)布時間：2017-07-29 14:30

  本文關(guān)鍵詞：組成型表達雞致病性大腸桿菌fimA與ompC融合蛋白的重組乳酸桿菌的構(gòu)建及其在雞腸道定殖特性的研究

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【摘要】：禽大腸桿菌病(avian colibacillosios)是由禽致病性大腸埃希氏菌(APEC)感染禽類引起的多種臨床病型的總稱。主要表現(xiàn)有胚胎和幼雛的死亡、敗血癥、氣囊炎、心包炎、輸卵管炎、腸炎、腹膜炎和大腸桿菌性肉芽腫等。病原性大腸埃希氏菌(E.coli)血清型眾多,抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜,給防治本病帶來了困難,因此,尋求針對主要致病大腸桿菌免疫保護譜廣的抗原物質(zhì),并模擬其自然感染的黏膜免疫,對該病的特異性免疫防治具有重要的實踐意義。為得到引發(fā)黏膜免疫并傳遞特異性抗原物質(zhì)的活菌載體,本實驗從健康雞腸道分離乳酸桿菌進行鑒定,并對其對于腸道的粘附能力和耐藥性進行了檢測。通過形態(tài)、培養(yǎng)、生化特性鑒定以及16s rRNA鑒定,共獲得了8株乳酸桿菌,其中包括3株Lactobacillus crispatus(卷曲乳桿菌)、2株Lactobacillus johnsonii(約氏乳桿菌)、2株Lactobacillus salivarius(唾液乳桿菌)和1株Lactobacillus saerimneri。8株乳酸桿菌在37℃和42℃均能良好生長;抑菌試驗表明,對革蘭氏陽性及陰性細菌均有一定的抑菌活性。體外粘附實驗表明,8株乳酸桿菌均具有一定的粘附特性,可在腸道內(nèi)定殖�？股孛舾行詫嶒灡砻�8株乳酸桿菌對多種抗生素敏感。在特異性抗原物質(zhì)的制備上,選用APEC O1血清型的I型菌毛A(FimA)和外膜蛋白C(Omp C)作為靶抗原基因片段,以APEC基因組為模板,A1和A2為引物,經(jīng)PCR擴增5’端帶有Apal I酶切位點和linker序列,3’端帶有ApaⅠ酶切位點的528bp的基因片斷FimA。以C1、C2為引物,擴增5’端帶有SacⅠ酶切位點和Flag標簽序列,3’端帶有ApalⅠ酶切位點的1074bp的基因片段Omp C。再將FimA和Omp C與T載體進行亞克隆連接構(gòu)建,獲得二者基因融合的重組質(zhì)粒p MD18-T-Omp C-fim A,構(gòu)建了I型菌毛A(Fim A)和外膜蛋白C(Omp C)的融合基因片段。利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和ApaⅠ將融合基因片段酶切后定向插入含有HCE組成型強啟動子并具有錨定結(jié)構(gòu)序列(Anchor)的乳酸菌組成型表面表達載體pPG-T7g10-PPT中,并將重組質(zhì)粒p PG-T7g10-PPT-Omp C-FimA電轉(zhuǎn)化入工程菌干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393和雞腸道分離的乳酸桿菌M-11(Lactobacillus saerimneri)中,構(gòu)建獲得了兩株重組菌pPG-T7g10-PPT-Omp C-FimA/L393和pPG-T7g10-PPT-Omp C-FimA/M-11。Western blot檢測結(jié)果表明融合基因在兩株乳酸桿菌中均獲得了表達,出現(xiàn)了約101KDa的特異性反應(yīng)帶。重組乳酸桿菌在雞腸道內(nèi)定殖特性分析結(jié)果表明,飼喂重組菌可以使肉仔雞的日增重明顯增加,與對照組相比差異顯著;模擬腸道環(huán)境中,重組菌可耐受pH=3的酸性環(huán)境,在0.1%的膽汁酸鹽環(huán)境中可良好生長;重組菌可在雞腸道內(nèi)定殖,在免疫后的14天,重組菌的數(shù)量趨于穩(wěn)定,一直持續(xù)需到免疫后的第28天,重組菌的數(shù)量保持穩(wěn)定,可見重組菌能夠在雞腸道內(nèi)定殖。綜上,本研究通過雞腸道內(nèi)乳酸菌的分離鑒定,獲得了8株乳酸桿菌,利用乳酸菌組成型表達載體質(zhì)粒,構(gòu)建了表達APEC保護性抗原FimA和Omp C串聯(lián)融合表達的重組乳酸桿菌,該重組菌能夠在雞腸道內(nèi)定殖,具有益生菌的特性,該菌株為防制禽致病性大腸埃希氏菌引起的大腸桿菌疾病提供理想的疫苗候選菌株。
【關(guān)鍵詞】：禽致病性大腸桿菌 保護性抗原FimA和OmpC 雞腸道乳酸桿菌 分離鑒定 重組乳酸桿菌
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-18
• 1.1 禽致病性大腸桿菌及其病原特性12-14
• 1.1.1 禽大腸桿菌病流行及危害12-13
• 1.1.2 禽致病性大腸桿菌生物學(xué)特性13-14
• 1.2 禽大腸桿菌病的防治現(xiàn)狀14-15
• 1.3 乳酸桿菌做為黏膜免疫遞送載體的研究進展15-17
• 1.3.1 黏膜免疫的機理研究15
• 1.3.2 乳酸桿菌遞送載體的研究現(xiàn)狀15-17
• 1.4 研究的目的與意義17-18
• 2 材料與方法18-34
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 菌種和質(zhì)粒18
• 2.1.2 實驗動物18
• 2.1.3 引物合成18-19
• 2.1.4 主要試劑19
• 2.1.5 主要實驗儀器與設(shè)備19
• 2.2 試驗方法19-34
• 2.2.1 雞腸道乳酸菌的分離及生化反應(yīng)特性鑒定19-22
• 2.2.2 乳桿菌生理特性試驗22
• 2.2.3 乳桿菌體外粘附實驗22-23
• 2.2.4 表達Omp C-FimA融合基因的重組乳酸桿菌的構(gòu)建23-31
• 2.2.5 重組乳酸桿菌的表達及鑒定31
• 2.2.6 重組乳酸桿菌在雞腸道內(nèi)的定殖特性31-34
• 3 結(jié)果34-53
• 3.1 雞腸道內(nèi)定殖的乳酸菌分離及生化反應(yīng)特性研究34-36
• 3.2 乳酸桿菌生理特性試驗36-40
• 3.2.1 乳酸桿菌在 37℃和 42℃生長特性的測定36-38
• 3.2.2 抑菌實驗結(jié)果38
• 3.2.3 藥物敏感性實驗結(jié)果38-40
• 3.3 乳酸桿菌體外粘附實驗結(jié)果40-41
• 3.4 表達OmpC-FimA融合基因的重組乳酸桿菌的構(gòu)建結(jié)果41-48
• 3.4.1 APEC的O1血清型FimA與OmpC基因的PCR擴增結(jié)果41-44
• 3.4.2 重組乳酸桿菌表達載體pPG-T7g10-PPT-OmpC-FimA的鑒定結(jié)果44-46
• 3.4.3 重組乳酸桿菌表達產(chǎn)物western blot鑒定46-48
• 3.5 重組乳酸桿菌在雞腸道內(nèi)定殖特性分析結(jié)果48-53
• 3.5.1 重組乳酸桿菌的安全性48-49
• 3.5.2 重組乳酸桿菌在消化道環(huán)境中的生存性能49-50
• 3.5.3 重組乳酸桿菌在雞腸道內(nèi)的定殖能力試驗50-53
• 4 討論53-57
• 4.1 腸道分離的乳酸桿菌的主要生物學(xué)特性53-54
• 4.2 主要免疫保護性抗原基因的選擇54
• 4.3 外源基因在乳酸菌中的表達情況54-55
• 4.4 外源基因電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌的影響因素55-56
• 4.5 重組乳酸桿菌在腸道中生存和定殖情況56-57
• 5 結(jié)論57-58
• 致謝58-59
• 參考文獻59-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64

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本文編號：589634