發(fā)布時(shí)間：2017-07-08 09:15

  本文關(guān)鍵詞：家蠅AS61、AS566和DefensinⅠ基因的表達(dá)及產(chǎn)物抑菌活性分析

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【摘要】：近年來(lái),抗生素在臨床診治上的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題越發(fā)嚴(yán)峻,嚴(yán)重影響了人類(lèi)以及動(dòng)物的健康,因此,研發(fā)不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性并且可代替抗生素的新型藥劑是目前急需解決的問(wèn)題。家蠅(Musca domestica)通常生活在陰暗潮濕、雜菌叢生的環(huán)境中,但因其具有獨(dú)特的防御體系而極少受到病原菌侵染。家蠅抗菌蛋白及抗菌肽作為家蠅防御體系中的重要成分,對(duì)多種病原菌均具有抗菌活性,且因其具有不易產(chǎn)生耐藥性和對(duì)人畜均無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn),已受到了國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。本研究以雞源致病性大腸桿菌以及雞源沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲(chóng)構(gòu)建抑制性消減文庫(kù)中所篩選到的差異基因?yàn)榛A(chǔ),以5'-RACE-Ready cDNA為模板,利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)對(duì)一個(gè)未知功能基因AS61進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增,對(duì)其核酸序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-AS61,進(jìn)行原核表達(dá)并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行體外抑菌活性檢測(cè)。以課題組成功擴(kuò)增出的家蠅抗菌蛋白AS566、家蠅防御素基因DefensinⅠ為基礎(chǔ),成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-AS566和pGAPZαA-DefensinⅠ,并進(jìn)行真核表達(dá),對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行體外抑菌活性檢測(cè)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、成功擴(kuò)增出AS61基因全長(zhǎng)序列,其ORF序列長(zhǎng)度為537 bp。AS61生物信息學(xué)分析結(jié)果:AS61基因編碼179個(gè)氨基酸,其理論等電點(diǎn)為7.61,呈疏水性,不存在跨膜區(qū),含信號(hào)肽,二級(jí)結(jié)構(gòu)含有α 螺旋、不規(guī)則盤(pán)繞和延伸鏈,存在少量β 折疊。2、成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-AS61并在大腸桿菌中獲得表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)條件:IPTG濃度為0.4 mM,誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。AS61表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白,大量存在于裂解液上清中。成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-AS566、pGAPZαA-DefensinⅠ并在畢赤酵母中分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分泌于上清液中,最佳表達(dá)時(shí)間為72 h。3、原核表達(dá)產(chǎn)物純化及濃縮后經(jīng)體外抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè),AS61對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌均無(wú)明顯抑制作用。真核表達(dá)產(chǎn)物濃縮后經(jīng)體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明,AS566對(duì)雞源沙門(mén)氏菌及豬源金黃色葡萄球菌均具有明顯抑制作用,對(duì)雞致病性大腸桿菌無(wú)明顯抑制作用;DefensinⅠ對(duì)大腸桿菌具有較弱的抑制作用,對(duì)沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌均無(wú)明顯抑制作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究這三種家蠅幼蟲(chóng)基因的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),并為新型抗菌藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 融合蛋白 分泌表達(dá) 抑菌活性
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S859.79
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 前言7-8
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述8-14
• 第一章 家蠅抗菌肽的研究進(jìn)展8-14
• 1.1 家蠅抗菌肽的分類(lèi)及結(jié)構(gòu)特征8-9
• 1.2 家蠅抗菌肽的抗菌機(jī)制9-10
• 1.3 家蠅抗菌肽編碼基因的原核表達(dá)10-11
• 1.4 家蠅抗菌肽基因的真核表達(dá)11-12
• 1.5 家蠅抗菌肽的生物活性12
• 1.6 家蠅抗菌肽的應(yīng)用前景12-14
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容14-50
• 第一章 家蠅幼蟲(chóng)差異基因的克隆及生物學(xué)分析14-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-21
• 1.3 結(jié)果與分析21-28
• 1.4 討論28
• 1.5 小結(jié)28-29
• 第二章 未知功能基因AS61的原核表達(dá)及抗菌蛋白AS566、防御素基因DefensinⅠ的真核表達(dá)29-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-36
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-41
• 2.4 討論41-42
• 2.5 小結(jié)42-43
• 第三章 表達(dá)產(chǎn)物的純化、濃縮及抑菌活性的鑒定43-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法44-45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-47
• 3.4 討論47-48
• 3.5 小結(jié)48-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 作者簡(jiǎn)介55-56
• 致謝56

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1 閆恕;家蠅AS61、AS566和DefensinⅠ基因的表達(dá)及產(chǎn)物抑菌活性分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：533889