本文關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒HH06株單克隆抗體制備及抗原捕捉ELISA方法建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。IBV血清型的復雜與多樣性加大了IBV的診斷難度,因此快速和高效的診斷方法對制定針對性的綜合防治方案有著深遠的意義。本實驗以IBV HH06株為免疫原,免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠,經(jīng)細胞融合、間接ELISA篩選和有限稀釋法克隆,最終得到3株能夠穩(wěn)定分泌抗IBV單克隆抗體的雜交瘤細胞株,將它們命名為A8、B11和H5,然后利用腹水制備法大量制備單克隆抗體。單克隆抗體細胞上清和腹水抗體效價分別是1:128-1:1 024和1:8 192-1:65 356,腹水抗體效價明顯高于細胞上清。Western blot結果顯示所有單克隆抗體均與IBV全病毒和S1蛋白發(fā)生特異性反應,IFA鑒定表明單抗可檢測到感染雞胚腎細胞(chicken embro kidney,CEK)中的HH06株IBV。Ig亞類鑒定A8、B11和H5均屬于Ig M,其雜交瘤細胞染色體計數(shù)平均數(shù)量在86-101條,病毒中和試驗顯示單抗A8、B11和H5抗IBV HH06中和效價分別為1:4.45、1:4.86和1:3.06,特異性試驗證明3株單抗僅與IBV發(fā)生特異性反應,不與禽傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、禽白血病(avian leukosis virus,ALV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)產(chǎn)生交叉反應,以上結果表明本實驗所制備的單抗可以用作IBV檢測方法的物質材料�？乖蹲紼LISA是一種快速高效的抗原檢測手段,兔抗IBV全病毒多抗為捕捉抗體,單克隆抗體B11作為檢測抗體,通過對各個條件進行優(yōu)化,得到最佳反應條件為:兔抗IBV多抗稀釋倍數(shù)為1:4 000,鼠抗IBV單抗B11檢測濃度為5μg/m L,待檢樣品孵育時間90 min,酶標二抗稀釋倍數(shù)為1:5 000。該方法板間、板內重復性變異系數(shù)均小于10%,最低檢出量為0.007 mg/m L,與陰性尿囊液及其他參考雞病病原無交叉反應。利用建立的AC-ELISA對M41株人工感染IBV雛雞不同時間腎臟、肺臟和氣管組織的多份樣本進行檢測,結果表明腎臟含毒量高且持續(xù)時間長,且檢測敏感性最高,肺臟和氣管次之,因此,該臨床檢測所選用的靶器官為腎臟,并將0.158(OD490 nm)作為陰陽性判定標準,因不同毒株侵染的組織器官具有一定的特異性,同時以肺臟和氣管作為輔助檢測的器官。綜上表明,建立的抗原捕捉ELISA方法具有較好的特異性和敏感性,可用于IBV的快速檢測。
【關鍵詞】：IBV 單克隆抗體 抗原捕捉ELISA 檢測
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-21
• 1.1 IBV病原學11-14
• 1.1.1 IBV基因組結構11-12
• 1.1.2 IBV結構蛋白12-14
• 1.2 IB流行病學14
• 1.3 IB致病機理14-15
• 1.4 IB臨床癥狀和病理變化15-16
• 1.5 IB診斷技術16-19
• 1.5.1 血清學診斷方法16
• 1.5.2 病毒分離16-17
• 1.5.3 電鏡鑒定17
• 1.5.4 免疫組織化學17-18
• 1.5.5 分子生物學診斷18-19
• 1.5.6 鑒別診斷19
• 1.6 IBV單克隆抗體研究進展19
• 1.7 研究目的和意義19-21
• 2 材料與方法21-33
• 2.1 實驗材料21-24
• 2.1.1 病毒株和質粒21
• 2.1.2 動物及細胞21
• 2.1.3 酶和主要試劑21-22
• 2.1.4 主要試劑配制22-23
• 2.1.5 儀器設備23-24
• 2.2 實驗方法24-33
• 2.2.1 IBV單克隆抗體的制備24-27
• 2.2.2 單克隆抗體生物學特征鑒定27-29
• 2.2.3 抗原捕捉ELISA方法建立與應用29-32
• 2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計32-33
• 3 結果33-52
• 3.1 IBV單克隆抗體的制備33-34
• 3.1.1 免疫抗原的制備33
• 3.1.2 ELISA篩選方法的建立33-34
• 3.1.3 雜交瘤細胞的篩選34
• 3.1.4 腹水制備34
• 3.2 單克隆抗體生物學特征鑒定34-42
• 3.2.1 單克隆抗體濃度與效價測定34-35
• 3.2.2 單克隆抗體Western blot鑒定35-37
• 3.2.3 單克隆抗體IFA檢測37-39
• 3.2.4 雜交瘤細胞分泌單克隆抗體穩(wěn)定性試驗39
• 3.2.5 雜交瘤細胞染色體計數(shù)39-40
• 3.2.6 單克隆抗體Ig亞類鑒定40-41
• 3.2.7 單克隆抗體中和活性鑒定41-42
• 3.2.8 單克隆抗體特異性分析42
• 3.3 IBV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法建立與應用42-52
• 3.3.1 抗原捕捉ELISA優(yōu)化42-48
• 3.3.2 抗原捕捉ELISA方法特異性試驗48
• 3.3.3 抗原捕捉ELISA方法靈敏性試驗48-49
• 3.3.4 抗原捕捉ELISA方法重復性試驗49-50
• 3.3.5 M41株IBV人工感染樣本的檢測50-52
• 4 討論52-55
• 4.1 抗原的制備52
• 4.2 單克隆抗體的制備52-53
• 4.3 單克隆抗體生物學特性鑒定53-54
• 4.4 AC-ELISA檢測方法建立54-55
• 5 結論55-56
• 致謝56-57
• 參考文獻57-65
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文65

  本文關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒HH06株單克隆抗體制備及抗原捕捉ELISA方法建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：500923