發(fā)布時(shí)間：2017-06-22 06:08

  本文關(guān)鍵詞：永生化山羊卵泡顆粒細(xì)胞系的建立及凋亡誘導(dǎo)因子對(duì)其凋亡的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在雌性哺乳動(dòng)物體內(nèi),儲(chǔ)存了數(shù)以萬計(jì)的原始卵泡,但僅有很少一部分可以被選擇并排卵。大多數(shù)卵泡會(huì)走向閉鎖,這是卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中的一個(gè)正常的生理學(xué)現(xiàn)象。目前認(rèn)為卵巢卵泡閉鎖的主要原因是顆粒細(xì)胞的凋亡,但是顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制并不是很清楚。凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)介導(dǎo)不依賴caspase的凋亡通路,會(huì)引起染色質(zhì)的濃縮和片段化。但是AIF在顆粒細(xì)胞凋亡中的作用并不完全清楚。雖然利用原代卵泡顆粒細(xì)胞可以對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡等方面進(jìn)行研究,但是無法長(zhǎng)期體外培養(yǎng)會(huì)限制一些研究的進(jìn)行。本研究通過向顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染hTERT基因的表達(dá)載體,篩選出具有永生化的山羊卵泡顆粒細(xì)胞系,以該細(xì)胞系為研究對(duì)象,探索AIF在顆粒細(xì)胞凋亡中的作用。(1)卵泡穿刺法獲取山羊卵泡顆粒細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pCI-neo-hTERT,用G418篩選獲得陽性克隆細(xì)胞,將陽性細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng),已培養(yǎng)至50代,命名為hTERT-GGCs。應(yīng)用PCR和免疫熒光方法,檢測(cè)證實(shí)hTERT基因在hTERT-GGCs中穩(wěn)定表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)表明甾體類激素合成通路中相關(guān)酶StAR(576bp)、CYP11A1(233bp)、CYP19A1(547bp)、CYP17A1(146bp)和促性腺素受體LHR(270bp)、ERα(846bp)、ERβ(634bp)的表達(dá)與GGCs無顯著差異。GGCs和hTERT-GGCs孕酮分泌量差異不顯著。hTERT-GGCs具有正常的核型,增值活力比GGCs旺盛,端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定,沒有致瘤性。(2)免疫組化和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),AIF主要在閉鎖卵泡中固縮的細(xì)胞和分散的顆粒細(xì)胞層中表達(dá),并隨著卵泡閉鎖程度的增加表達(dá)量升高;卵泡直徑的增大AIF基因表達(dá)量增強(qiáng)。根據(jù)山羊AIF基因設(shè)計(jì)干擾序列,構(gòu)建了慢病毒干擾載體,證明降低AIF基因表達(dá)水平,可以減少由于血清饑餓誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡。綜上所述,本研究建立了永生化的山羊卵泡顆粒細(xì)胞系。降低AIF基因表達(dá)水平可以減少由于血清饑餓誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：山羊 顆粒細(xì)胞 永生化 凋亡誘導(dǎo)因子 凋亡
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 文獻(xiàn)綜述12-24
• 第一章 卵泡顆粒細(xì)胞與細(xì)胞永生化研究進(jìn)展12-21
• 1.1 卵泡顆粒細(xì)胞12-14
• 1.1.1 顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育中的作用12-13
• 1.1.2 顆粒細(xì)胞的分泌功能13-14
• 1.2 卵泡顆粒細(xì)胞凋亡14-16
• 1.2.1 雌激素14
• 1.2.2 胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)14
• 1.2.3 消耗細(xì)胞生長(zhǎng)因子引起的凋亡14-15
• 1.2.4 FAS配合基和FAS系統(tǒng)15
• 1.2.5 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)15-16
• 1.2.6 BCL2家族成員(線粒體介導(dǎo)的凋亡)16
• 1.3 端粒與端粒酶16-17
• 1.3.1 端粒的結(jié)構(gòu)與功能16-17
• 1.3.2 端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能17
• 1.4 細(xì)胞永生化17-21
• 1.4.1 細(xì)胞衰老17-18
• 1.4.2 細(xì)胞危機(jī)18
• 1.4.3 細(xì)胞永生化的方法18-19
• 1.4.4 端粒酶對(duì)細(xì)胞永生化的作用與優(yōu)勢(shì)19-21
• 第二章 凋亡誘導(dǎo)因子研究進(jìn)展21-24
• 2.1 凋亡誘導(dǎo)因子的研究概況21-22
• 2.1.1 AIF在細(xì)胞程序性死亡中的作用21-22
• 2.1.2 AIF在凋亡細(xì)胞中致死作用的調(diào)控22
• 2.2 凋亡細(xì)胞中線粒體釋放AIF的調(diào)控22-23
• 2.3 凋亡誘導(dǎo)因子在細(xì)胞存活、增殖和新陳代謝中的作用23-24
• 試驗(yàn)研究24-56
• 第三章 永生化山羊卵泡顆粒細(xì)胞系的建立24-41
• 3.1 材料24
• 3.1.1 主要儀器24
• 3.1.2 主要試劑24
• 3.2 方法24-30
• 3.2.1 山羊卵巢的采集24
• 3.2.2 卵泡顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)24-25
• 3.2.3 pCI-neo-hTERT轉(zhuǎn)染山羊卵泡顆粒細(xì)胞25-26
• 3.2.4 hTERT-GGCs生物學(xué)鑒定26-30
• 3.3 結(jié)果30-38
• 3.3.1 山羊卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)30-31
• 3.3.2 pCI-neo-hTERT的鑒定31
• 3.3.3 新霉素(G418)最佳篩選濃度確定31-32
• 3.3.4 陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)32
• 3.3.5 hTERT-GGCs形態(tài)學(xué)觀察32
• 3.3.6 hTERT基因表達(dá)鑒定32-34
• 3.3.7 檢測(cè)甾體類激素合成相關(guān)基因的表達(dá)34
• 3.3.8 hTERT-GGCs增值活力和細(xì)胞周期檢測(cè)34-35
• 3.3.9 hTERT-GGCs甾體類激素合成水平的檢測(cè)35-37
• 3.3.10 軟瓊脂試驗(yàn)37
• 3.3.11 hTERT-GGCs核型分析37-38
• 3.3.12 hTERT-GGCs端粒長(zhǎng)度檢測(cè)38
• 3.4 討論38-39
• 3.5 小結(jié)39-41
• 第四章 凋亡誘導(dǎo)因子在山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡中的作用41-56
• 4.1 材料41
• 4.1.1 主要儀器41
• 4.1.2 主要試劑41
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)中涉及的細(xì)胞41
• 4.2 方法41-48
• 4.2.1 山羊卵巢組織包埋、切片41-42
• 4.2.2 免疫組織化學(xué)定位AIF42
• 4.2.3 山羊有腔卵泡的剝離和顆粒細(xì)胞的收集42
• 4.2.4 細(xì)胞全蛋白的提取42-43
• 4.2.5 Western Blot分析43
• 4.2.6 山羊AIF基因shRNA慢病毒載體構(gòu)建43-46
• 4.2.7 慢病毒的包裝46-48
• 4.3 結(jié)果48-54
• 4.3.1 AIF在山羊卵巢的定位48
• 4.3.2 AIF在顆粒細(xì)胞的表達(dá)水平48-49
• 4.3.3 慢病毒干擾載體PCR鑒定49-50
• 4.3.4 慢病毒包裝質(zhì)粒鑒定50-51
• 4.3.5 慢病毒包裝與滴度檢測(cè)51-52
• 4.3.6 有效干擾片段的篩選52-53
• 4.3.7 AIFshRNA對(duì)hTERT-GGCs饑餓誘導(dǎo)的凋亡的影響53-54
• 4.4 討論54-55
• 4.5 小結(jié)55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-68
• 縮略詞68-69
• 致謝69-70
• 作者簡(jiǎn)介70

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