本文關(guān)鍵詞：環(huán)丙沙星壓力下鼠傷寒和腸炎沙門(mén)菌的適應(yīng)性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：非傷寒沙門(mén)菌是最常見(jiàn)的食源性和水源感染的重要病原菌。隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn)和日益增多,耐藥菌可隨著食物鏈從動(dòng)物擴(kuò)散到人類(lèi),對(duì)人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重的威脅。氟喹諾酮類(lèi)藥物因其獨(dú)特的抗菌機(jī)理和廣譜的抗菌療效,被用作治療沙門(mén)菌感染的首選藥物。然而隨著這類(lèi)藥物的長(zhǎng)期和廣泛使用,其耐藥性也隨之快速產(chǎn)生,成為臨床治療的極大負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)室前期流行病學(xué)調(diào)查研究表明,養(yǎng)殖場(chǎng)普遍流行的沙門(mén)菌優(yōu)勢(shì)血清型為鼠傷寒型,且表現(xiàn)出對(duì)氟喹諾酮類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)等藥物的多重耐藥表型。因此在耐藥發(fā)展過(guò)程中,優(yōu)勢(shì)血清型沙門(mén)氏菌是否具有低適應(yīng)性代償而得以普遍流行并在環(huán)境中持續(xù)存在?為了解釋這一現(xiàn)象,本研究篩選了從養(yǎng)殖場(chǎng)分離到的兩種(鼠傷寒型和腸炎型)血清型沙門(mén)菌,在不同環(huán)丙沙星壓力下進(jìn)行誘導(dǎo)獲得逐步耐藥突變株,從耐藥發(fā)展過(guò)程、菌株的生長(zhǎng)能力、不同血清型菌株間的競(jìng)爭(zhēng)能力、及在不同濃度膽鹽脅迫下菌株的生存能力和侵襲能力等幾個(gè)方面來(lái)探討這兩種血清型的沙門(mén)菌在環(huán)丙沙星選擇壓力下的適應(yīng)性差異。在不同培養(yǎng)條件下,逐步篩選出耐環(huán)丙沙星的鼠傷寒和腸炎型沙門(mén)菌的突變株。采用二倍瓊脂稀釋法測(cè)定各突變株的MIC,并且采用PCR的方法檢測(cè)喹諾酮類(lèi)藥物作用靶位基因gyrA、gyrB、parC、parE的突變。結(jié)果顯示這兩種血清型的親本株都沒(méi)有發(fā)生QRDR的突變。LB培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn),腸炎型沙門(mén)菌表現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星敏感性降低時(shí)(MIC,0.125 mg/L),gyr B發(fā)生S464F突變,在高水平耐藥時(shí)(MIC,32mg/L)又增加了gyrA的D87A與parE的V461G突變。M9培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo),腸炎型沙門(mén)菌表現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星敏感性降低時(shí)(MIC,0.125 mg/L)gyrB出現(xiàn)S464F突變,但是高水平耐藥時(shí)(MIC,32mg/L)又增加了gyrA的S83F的突變;對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)菌,在LB培養(yǎng)條件下,當(dāng)誘導(dǎo)出現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星敏感性降低表型時(shí),gyrA發(fā)生G81D的突變,進(jìn)一步誘導(dǎo)后環(huán)丙沙星的MIC達(dá)到16mg/L,在parC額外增加了G78D的突變,隨后該突變位點(diǎn)消失,環(huán)丙沙星的MIC降至4mg/L,即使再增加環(huán)丙沙星誘導(dǎo)濃度,環(huán)丙沙星MIC仍然為4mg/L。但是在M9培養(yǎng)條件下,鼠傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)至環(huán)丙沙星MIC為1mg/L時(shí),gyrB發(fā)生S464Y的突變,進(jìn)一步誘導(dǎo)至環(huán)丙沙星MIC為4mg/L時(shí),在gyr A又額外增加了S83Y的突變,但隨后該突變位點(diǎn)消失,即使再增加環(huán)丙沙星誘導(dǎo)濃度,環(huán)丙沙星MIC仍然為1mg/L。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩種血清型突變株外排泵相關(guān)基因的表達(dá)水平,以確定AcrAB-TolC外排泵是否發(fā)生過(guò)表達(dá)以及與其表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)的調(diào)控因子。結(jié)果表明腸炎沙門(mén)菌耐藥突變株的AcrAB-TolC外排活性增強(qiáng),而鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥突變株AcrAB-TolC外排活性沒(méi)有明顯改變。腸炎沙門(mén)菌中RamA作為主要的調(diào)控因子對(duì)AcrAB-TolC外排泵的表達(dá)起到調(diào)控作用。采用滴板法檢測(cè)了不同營(yíng)養(yǎng)條件下這兩種血清型菌株的生長(zhǎng)能力,另外也測(cè)定了在添加了不同濃度膽鹽的情況下兩種血清型菌株的生長(zhǎng)能力,以確定這兩種血清型的菌株在不同環(huán)境中的適應(yīng)性生存能力。結(jié)果表明在最初抗生素壓力下,腸炎型沙門(mén)菌的生長(zhǎng)能力顯著大于鼠傷寒沙門(mén)菌;但是隨著抗生素壓力的增加及持續(xù),鼠傷寒沙門(mén)菌耐藥菌株的生長(zhǎng)能力顯著大于腸炎沙門(mén)菌耐藥菌株。采用焦磷酸測(cè)序法測(cè)定同一誘導(dǎo)壓力下不同耐藥水平的兩種血清型沙門(mén)菌的競(jìng)爭(zhēng)能力。結(jié)果表明,對(duì)環(huán)丙沙星敏感的鼠傷寒沙門(mén)菌其競(jìng)爭(zhēng)能力弱于腸炎沙門(mén)菌,而耐藥的鼠傷寒沙門(mén)菌比同一誘導(dǎo)濃度下的腸炎沙門(mén)菌更具有競(jìng)爭(zhēng)能力。另外,也測(cè)定了不同膽鹽濃度下,鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌對(duì)Hela細(xì)胞侵襲能力的差異。結(jié)果表明,在不加膽鹽和0.1%的膽鹽濃度下,鼠傷寒沙門(mén)菌的侵襲能力弱于腸炎沙門(mén)菌,但是在1%膽鹽濃度下,鼠傷寒沙門(mén)菌的侵襲能力強(qiáng)于腸炎沙門(mén)菌。結(jié)論:兩種血清型沙門(mén)氏菌耐藥發(fā)展機(jī)制存在差異,鼠傷寒沙門(mén)菌在抗生素選擇壓力下耐藥性的獲得除了靶位基因gyrA發(fā)生突變,還與除AcrAB-TolC外的其他外排泵作用有關(guān);腸炎型沙門(mén)菌耐藥性獲得主要是由于AcrAB-TolC外排泵的過(guò)表達(dá)及靶位基因突變所致;當(dāng)菌株獲得環(huán)丙沙星耐藥表型后的鼠傷寒沙門(mén)菌比對(duì)腸炎沙門(mén)菌更具有適應(yīng)性?xún)?yōu)勢(shì),而且在高膽鹽環(huán)境下鼠傷寒沙門(mén)菌的侵襲能力強(qiáng)于腸炎沙門(mén)菌。
【關(guān)鍵詞】：血清型 沙門(mén)菌 適應(yīng)性 耐藥性 膽鹽
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-13
• 2 材料與方法13-26
• 2.1 材料13-14
• 2.1.1 樣品來(lái)源與參考菌株13
• 2.1.2 常規(guī)用培養(yǎng)基和試劑13
• 2.1.3 Real-Time PCR用試劑13
• 2.1.4 常用試劑的配制13-14
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備14
• 2.2 方法14-26
• 2.2.1 菌株復(fù)蘇14-15
• 2.2.2 體外誘導(dǎo)15
• 2.2.3 二倍瓊脂稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MICS）15-17
• 2.2.4 QRDR（S）突變的檢測(cè)17-19
• 2.2.5 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定19
• 2.2.6 突變株中外排泵相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè)19-23
• 2.2.7 生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)23-24
• 2.2.8 膽鹽的耐受24
• 2.2.9 細(xì)胞的侵襲24-26
• 3 結(jié)果與分析26-37
• 3.1 兩種血清型沙門(mén)菌QRDR突變和抗生素敏感性的測(cè)定26-29
• 3.2 兩種血清型沙門(mén)菌的生長(zhǎng)能力29-31
• 3.3 外排泵相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)31-33
• 3.4 生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)33-34
• 3.5 膽鹽的耐受34-36
• 3.6 沙門(mén)菌的侵襲能力36-37
• 4 討論37-42
• 全文總結(jié)42-43
• 致謝43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 潘渭涓;陳祥;王曉泉;叢秋霞;潘志明;高崧;焦新安;;1993-2008年禽源大腸桿菌和沙門(mén)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性分析[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2009年07期

  本文關(guān)鍵詞：環(huán)丙沙星壓力下鼠傷寒和腸炎沙門(mén)菌的適應(yīng)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：459403