本文關(guān)鍵詞：類彈性蛋白多肽融合犬干擾素的表達(dá)、純化和活性檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：干擾素(interferon, IFN)是一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用的細(xì)胞因子,其中犬重組α干擾素已廣泛應(yīng)用于犬病毒性疾病的治療,并獲得良好的治療效果。但現(xiàn)有的重組α干擾素多以組氨酸標(biāo)簽融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體表達(dá)并經(jīng)過變性、復(fù)性和層析純化的方式制備。此方法制備的重組α干擾素不僅價格高,且體內(nèi)半衰期短。延長干擾素體內(nèi)半衰期的常見方式有聚乙二醇化和與血清白蛋白等蛋白標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá),前者反應(yīng)條件和產(chǎn)品質(zhì)量控制困難,后者仍然需要使用親和層析等成本較高的方法純化。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一類由五個氨基酸組成的聚合物,具有溫度敏感的可逆相變特性,可用離心等簡單方法分離純化,已被用作重組蛋白的純化標(biāo)簽。另外,由于良好的生物相容性,ELP還被用作體內(nèi)藥物載體,以起緩釋和延長半衰期的作用。犬IL-29(CaIL-29)抗病毒作用有別于CaIFN-α,目前尚無基因工程產(chǎn)品上市。犬γ干擾素(CaIFN-γ)除具有抗病毒作用,還有免疫調(diào)節(jié)作用。本研究用PCR擴(kuò)增CaIL-29和CaIFNα1成熟肽編碼序列,將其分別插入ELP融合表達(dá)載體pET-ELP,獲得重組表達(dá)載體pCaIL29-ELP和pELP-CaIFNα。再將合成的CaIFN-γ成熟肽序列插入pELP-CaIFNα中,獲得CaIFN-α與CaIFN-γ融合表達(dá)載體pELP-CaIFNαγ。分別將重組載體轉(zhuǎn)化BLR(DE3)和BL21(DE3)大腸桿菌,在37℃用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示：pCaIL29-ELP、pELP-CaIFNα和pELP-CaIFNaγ重組菌均表達(dá)預(yù)期大小的融合蛋白,其中CaIL29-ELP融合蛋白為不溶性包涵體,ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ為可溶性表達(dá)。然后在優(yōu)化條件下進(jìn)行CaIL29-ELP融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析結(jié)果顯示在低于26℃條件下為可溶性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上對IPTG誘導(dǎo)濃度和時間進(jìn)行了優(yōu)化,CaIL29-ELP、 pELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.2mM IPTG、24℃和24h。分別在優(yōu)化條件下進(jìn)行CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ誘導(dǎo)表達(dá),對純化融合蛋白的相變溫度、鹽濃度等相變循環(huán)(ITC)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示CaIL29-ELP、 ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的相變溫度分別為26℃、26℃和39℃,最佳氯化鈉濃度分別為3mol/L、3mol/L和3mol/L。純化融合蛋白用6mol/L尿素溶解,透析后進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示CaIL29-ELP融合蛋白的純度為74%,濃度為0.08mg/mL; ELP-CaIFNα融合蛋白的純度為79%,濃度為0.14mg/mL; ELP-CaIFNαγ融合蛋白的純度為82%,濃度為0.13mg/mL以MDCK/VSV系統(tǒng)進(jìn)行干擾素活性檢測,結(jié)果顯示CaIL29-ELP的抗病毒活性為2.5×104U/mg, ELP-CaIFNα的抗病毒效價為1.4×105U/mg, ELP-CaIFNαγ抗病毒效價為8.4×1 03U/mg。這些研究結(jié)果表明,本研究獲得的CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ融合干擾素具有較高的純度和較強的抗病毒活性,并可能有較長的體內(nèi)半衰期,有望用于犬病毒病的治療。
【關(guān)鍵詞】：犬干擾素 類彈性蛋白多肽 融合表達(dá) 分離純化 抗病毒活性
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S858.292
【目錄】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-6
• 符號說明6-10
• 綜述一：犬干擾素的研究進(jìn)展10-14
• 1. 干擾素的研究進(jìn)展10-14
• 1.1 干擾素的分類10
• 1.2 干擾素的生物學(xué)特性及應(yīng)用10-12
• 1.3 基因工程干擾素研究進(jìn)展12
• 1.4 犬干擾素的研究進(jìn)展12-14
• 綜述二：重組蛋白標(biāo)簽的研究進(jìn)展14-17
• 1. 融合標(biāo)簽14-16
• 2. ELP標(biāo)簽的應(yīng)用16-17
• 研究內(nèi)容一：類彈性蛋白多肽融合犬白介素29的表達(dá)與活性檢測17-34
• 1. 材料17-19
• 1.1 生物材料和主要試劑17-18
• 1.2 主要儀器設(shè)備18
• 1.3 培養(yǎng)基和常用溶液18-19
• 2 實驗方法19-28
• 2.1 基因克隆19-22
• 2.2 表達(dá)載體構(gòu)建22-23
• 2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)23-24
• 2.4 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化24-26
• 2.5 融合干擾素活性檢測26-28
• 3 結(jié)果28-33
• 3.1 基因擴(kuò)增28-29
• 3.2 pCaIL29-ELP構(gòu)建29
• 3.3 融合蛋白表達(dá)29-31
• 3.4 相變循環(huán)參數(shù)優(yōu)化31-32
• 3.5 融合蛋白純化32
• 3.6 融合蛋白的活性測定32-33
• 4 討論33-34
• 研究內(nèi)容二：類彈性蛋白多肽融合犬α干擾素的表達(dá)與活性檢測34-43
• 1 材料34-35
• 1.1 菌株、細(xì)胞、病毒34
• 1.2 主要工具酶與試劑34
• 1.3 培養(yǎng)基和常用溶液34
• 1.4 主要儀器34-35
• 2 實驗方法35-39
• 2.1 基因克隆35-36
• 2.2 表達(dá)載體構(gòu)建36-38
• 2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)38
• 2.4 表達(dá)產(chǎn)物分析38
• 2.5 表達(dá)條件優(yōu)化38
• 2.6 融合蛋白純化38
• 2.7 干擾素活性測定38-39
• 3 結(jié)果39-42
• 3.1 融合表達(dá)載體構(gòu)建39
• 3.2 融合蛋白表達(dá)分析39-40
• 3.3 融合蛋白表達(dá)條件優(yōu)化40-41
• 3.4 沉淀ELP-CaIFN α 1的鹽濃度41
• 3.5 ELP-CaIFN α 1融合蛋白的純化41-42
• 3.6 干擾素的活性測定42
• 4 討論42-43
• 研究內(nèi)容三：ELP-CaIFN α-CaIFN γ的融合表達(dá)與抗病毒活性檢測43-50
• 1 材料43-44
• 1.1 生物材料43
• 1.2 工具酶與試劑43
• 1.3 培養(yǎng)基和常用溶液43
• 1.4 主要儀器43-44
• 2 實驗方法44-47
• 2.1 表達(dá)載體構(gòu)建44-46
• 2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)46
• 2.3 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化46
• 2.4 表達(dá)條件優(yōu)化46
• 2.5 融合蛋白純化46
• 2.6 干擾素活性測定46-47
• 3 結(jié)果47-49
• 3.1 表達(dá)載體構(gòu)建47
• 3.2 融合蛋白表達(dá)分析47-48
• 3.3 相變循環(huán)鹽濃度優(yōu)化48
• 3.4 融合蛋白純化48-49
• 3.5 融合干擾素的活性測定49
• 4 討論與總結(jié)49-50
• 全文總結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 致謝56-57

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設(shè)計實驗室公司買下融合蛋白技術(shù)實用權(quán)[J];生物技術(shù)通報;1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應(yīng)用及研究[J];生物工程進(jìn)展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號：458444