本文關(guān)鍵詞：OmpX過表達(dá)對腸外致病性大腸桿菌ΔtolC株生物被膜形成特性的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)作為一種重要的人獸共患病病原和食源性致病菌而備受關(guān)注。它可通過污染食物、水源和飼料等造成傳播,引起人和動物的腸外組織感染。而生物被膜形成增強(qiáng)了其多重耐藥性和體內(nèi)外抗逆特性,更增加其防控難度。因此,必須加強(qiáng)對細(xì)菌生物被膜形成機(jī)制及影響因子的研究,以便制定有效的防控策略。外膜蛋白TolC作為革蘭氏陰性菌多種外排泵系統(tǒng)的主要組成部分,不僅介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的分子外排和自身代謝分子、毒素分子的外排,而且在維持外膜完整性和生物被膜形成過程中也具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明TolC參與ExPEC對外界高滲環(huán)境的響應(yīng)性,并通過調(diào)節(jié)Curli菌毛的合成而影響生物被膜的形成。從蛋白水平研究表明tolC基因缺失可導(dǎo)致外膜蛋白OmpX表達(dá)顯著降低。OmpX作為毒力蛋白可參與細(xì)菌的致病過程,介導(dǎo)細(xì)菌對上皮細(xì)胞的黏附和入侵,并參與細(xì)菌對外界環(huán)境滲透壓的適應(yīng)性。是否OmpX介導(dǎo)TolC失活對ExPEC高滲環(huán)境響應(yīng)性和生物被膜形成的作用?業(yè)已證明ompX缺失不影響ExPEC生物被膜形成,故本研究通過在△tolC突變菌株中導(dǎo)入OmpX過表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)一步探討OmpX過表達(dá)對△tolC株生物被膜形成特性的影響。主要研究結(jié)果如下:1.高滲培養(yǎng)條件下ExPEC Omp X表達(dá)分析:qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),在NaCl和蔗糖形成的高滲培養(yǎng)基條件下,ExPEC OmpX的表達(dá)量明顯升高,提示OmpX表達(dá)可能是ExPEC對環(huán)境高滲應(yīng)激的一種響應(yīng)機(jī)制。2.OmpX過表達(dá)菌株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究:構(gòu)建了ompX全長基因表達(dá)質(zhì)粒pHSG396:ompX,采用電轉(zhuǎn)化方法分別導(dǎo)入ExPEC PPECC42野生株(WT)及其△tolC菌株,構(gòu)建兩種親本株的OmpX過表達(dá)菌株。生長曲線結(jié)果表明,OmpX過表達(dá)不影響菌株在M9、1/2M9完全培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的生長速度。對試驗(yàn)菌株最低抑菌濃度(MIC)檢測結(jié)果表明,TolC失活可造成ExPEC對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、四環(huán)素、阿米卡星、SDS的耐藥性得到明顯改善,但TolC失活同時過表達(dá)OmpX時可恢復(fù)細(xì)菌對這幾種藥物的耐受性。體外細(xì)胞致病試驗(yàn)結(jié)果表明,tolC缺失引起ExPEC對人肺上皮細(xì)胞A549黏附侵襲能力和在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的存活能力顯著減弱,但同時過表達(dá)OmpX后可部分恢復(fù)tolC缺失引起的這些作用。3.OmpX過表達(dá)對菌株生物被膜形成和Curli合成的影響:采用結(jié)晶紫染色法評價了試驗(yàn)菌株的生物被膜形成能力,結(jié)果表明在1/2M9低滲培養(yǎng)條件下,WT、△tolC及其OmpX過表達(dá)菌株均呈現(xiàn)強(qiáng)生物被膜形成能力;但在M9高滲培養(yǎng)基中,△tolC呈現(xiàn)弱生物被膜形成能力,但△tolC::ompX恢復(fù)了與WT相一致的強(qiáng)生物被膜形成能力。進(jìn)而檢測了試驗(yàn)菌株在1/2M9培養(yǎng)基中添加不同濃度NaCl或蔗糖形成高滲條件下的生物被膜形成能力,結(jié)果顯示tolC缺失可導(dǎo)致Ex PEC生物被膜形成能力對高滲環(huán)境的抵抗能力減弱,但△tolC::ompX可部分或全部恢復(fù)菌株生物被膜形成能力對高滲環(huán)境的抵抗。Curli菌毛是ExPEC生物被膜形成的關(guān)鍵成分。本研究采用剛果紅平板試驗(yàn)分析了試驗(yàn)菌株的Curli菌毛合成能力,結(jié)果顯示:在M9培養(yǎng)基中,△tolC株呈現(xiàn)缺乏Curli菌毛的saw菌落表型,而△tolC::ompX株呈現(xiàn)與WT株相似的可形成Curli菌毛的rdar菌落表型;但在1/2M9培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌株均呈現(xiàn)rdar菌落表型。進(jìn)而qRT-PCR檢測結(jié)果證實(shí),OmpX過表達(dá)對△tolC株Curli菌毛合成能力的代償是由于調(diào)控Curli合成相關(guān)基因csgB和csgD的轉(zhuǎn)錄水平。4.轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選TolC和OmpX調(diào)節(jié)生物被膜形成的靶標(biāo):為進(jìn)一步探討TolC和OmpX參與高滲環(huán)境抗性和生物被膜形成的分子機(jī)制,本研究采用RNA-seq技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平分析了高鹽和高糖培養(yǎng)條件下WT、△tolC與△tolC::ompX菌株之間的差異表達(dá)基因,篩選到一系列生物被膜形成和細(xì)菌抗?jié)B透性相關(guān)基因,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、多壓力反應(yīng)蛋白Bhs A、以及cpx雙組份信號系統(tǒng)輔助蛋白CpxP等。總之,ExPEC外膜蛋白OmpX可能通過上調(diào)表達(dá)響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激,參與細(xì)菌生物被膜的形成;過量表達(dá)OmpX可彌補(bǔ)TolC缺失造成的細(xì)菌Curli菌毛和生物被膜形成能力的缺陷。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果,過量表達(dá)OmpX對TolC缺失株高滲耐受性和生物被膜的補(bǔ)償作用可能主要通過調(diào)節(jié)雙組份系統(tǒng)和壓力反應(yīng)系統(tǒng)來完成。
【關(guān)鍵詞】：ExPEC 生物被膜 Curli菌毛 高滲應(yīng)激 TolC OmpX
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞（ABBREVIATION）11-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-24
• 1.1 腸外致病性大腸桿菌概述13-16
• 1.1.1 大腸桿菌的簡介和分類13-14
• 1.1.2 腸外致病性大腸桿菌概述14
• 1.1.3 腸外致病性大腸桿菌的流行病學(xué)分析14
• 1.1.4 腸外致病性大腸桿菌的主要致病機(jī)制14-15
• 1.1.5 腸外致病性大腸桿菌的診斷和防治15-16
• 1.2.生物被膜概述16-20
• 1.2.1.生物被膜概述及危害16
• 1.2.2.生物被膜的形成過程及主要的參與因子16-19
• 1.2.3 生物被膜形成的調(diào)節(jié)機(jī)制19-20
• 1.2.4 大腸桿菌生物被膜的控制和清除20
• 1.3.大腸桿菌外膜蛋白概述20-24
• 1.3.1.外膜蛋白簡介、結(jié)構(gòu)、分類及功能20-21
• 1.3.2.外膜蛋白Tol C概述21-22
• 1.3.3 外膜蛋白Omp X概述22-24
• 2.研究目的和意義24-25
• 3.材料與方法25-35
• 3.1 材料25-28
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒25-26
• 3.1.2 主要試劑、試劑盒與儀器26-27
• 3.1.3 主要培養(yǎng)基、抗生素及相關(guān)溶液的配置27-28
• 3.2 方法28-35
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成28-29
• 3.2.2 豬源Ex PEC的復(fù)蘇增殖和基因組DNA提取29
• 3.2.3 質(zhì)粒的小量制備29
• 3.2.4 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備29
• 3.2.5 WT::omp X和△tol C::omp X菌株的構(gòu)建29-30
• 3.2.6 試驗(yàn)菌株生長特性的測定30
• 3.2.7 試驗(yàn)菌株對抗菌藥物最小抑菌濃度（MIC）的測定30-31
• 3.2.8 細(xì)胞黏附侵襲能力測定31
• 3.2.9 巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力測定31
• 3.2.10 生物被膜形成能力測定31-32
• 3.2.11 Curli合成能力的評價32
• 3.2.12 高滲應(yīng)激環(huán)境對生物被膜的形成能力的影響32
• 3.2.13 Curli菌毛轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證32-33
• 3.2.14 q RT-PCR驗(yàn)證高滲條件Omp X的表達(dá)量33-34
• 3.2.15 轉(zhuǎn)錄組分析差異基因34
• 3.2.16 數(shù)據(jù)分析34-35
• 4.結(jié)果與分析35-46
• 4.1 PPECC42全基因組測序35
• 4.2 過表達(dá)菌株的構(gòu)建并驗(yàn)證表達(dá)35-36
• 4.3 生長特性評價測定36-37
• 4.3.1 遺傳穩(wěn)定性評價36-37
• 4.3.2 生長曲線測定37
• 4.4 最小抑菌濃度（MIC）測定37-38
• 4.5 細(xì)胞黏附侵襲能力分析38
• 4.6 巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力分析38-39
• 4.7 生物被膜形成能力分析39-42
• 4.7.1 生物被膜形成能力分析39-40
• 4.7.2 高滲應(yīng)激對生物被膜形成的影響40
• 4.7.3 Curli合成能力評價40-41
• 4.7.4 q RT-PCR驗(yàn)證Curli合成相關(guān)基因csg D和csg B的轉(zhuǎn)錄表達(dá)41-42
• 4.8 q RT-PCR檢測高滲條件下Omp X的表達(dá)量42
• 4.9 轉(zhuǎn)錄組分析差異基因42-46
• 4.9.1 差異基因表達(dá)分析42-43
• 4.9.2 靶標(biāo)差異基因的篩選43-46
• 5 討論46-49
• 5.1 Omp X與Tol C相互作用調(diào)節(jié)細(xì)菌抗?jié)B透應(yīng)激和生物被膜的形成46
• 5.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序?qū)ふ以谏锉荒ず涂節(jié)B透方面的差異基因46-47
• 5.3 差異基因cpx P和bhs A在生物被膜和抗?jié)B透方面的功能47-49
• 6 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-61
• 附錄61-62
• 致謝62

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本文編號：458253