本文關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌lgtB和lex-1基因在脂寡糖合成及致病過程中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是定植于豬上呼吸道的條件性致病菌,臨床上常引起以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等為特征的格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)。由于HPS血清型眾多,不同血清型間毒力差異很大,缺乏免疫交叉性,所以至今為止還沒有很好的防控副豬嗜血桿菌病的方法。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)HPS致病相關(guān)因子進(jìn)行了諸多研究,發(fā)現(xiàn)脂寡糖是潛在的毒力因子之一,可以介導(dǎo)HPS的粘附作用和誘導(dǎo)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)。然而與脂寡糖合成相關(guān)的基因仍有待深入研究。LgtB/lex-1是HPS基因組上尚待研究的兩個(gè)基因。在其他菌中已有報(bào)道lgtB/lex-1編碼β-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶是糖基轉(zhuǎn)移酶家族25(Glycosyltransferase family 25)的成員,參與脂寡糖的合成。因此,本研究旨在分析HPS lgtB/lex-1基因在脂寡糖合成及HPS致病過程中的作用。本研究首先構(gòu)建了lgtB的缺失突變載體質(zhì)粒pZQ001和lex-1的缺失突變載體質(zhì)粒pZQ002,利用自然轉(zhuǎn)化的方法將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化親本菌株HPS SC096分別獲得了缺失lgtB基因和lex-1基因的重組菌ΔlgtB株和Δlex-1株;其次構(gòu)建了互補(bǔ)載體質(zhì)粒pZQ003和pZQ004,用相同的自然轉(zhuǎn)化方法獲得了ΔlgtB-c和Δlex-1-c互補(bǔ)菌株;通過PCR及測(cè)序確定菌株構(gòu)建正確。為了觀察lgtB/lex-1基因缺失后脂寡糖的變化,本研究提取了野生菌株和重組菌株的脂寡糖,通過SDS-PAGE及銀染等方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示ΔlgtB和Δlex-1缺失株的脂寡糖的泳動(dòng)速度均明顯快于野生菌株,表明lgtB/lex-1基因缺失后菌株的脂寡糖分子量變小,脂寡糖鏈的長(zhǎng)度在基因缺失之后變短,說明lgtB/lex-1基因參與脂寡糖的合成。而互補(bǔ)菌株ΔlgtB-c和Δlex-1-c的脂寡糖的泳動(dòng)速度和野生菌株一致,說明lgt B/lex-1互補(bǔ)成功。本文研究了lgtB/lex-1基因缺失后對(duì)菌株抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺傷作用的影響。結(jié)果表明在缺失lgtB/lex-1后HPS的存活率由親本株的74.92%分別降至15.00%和54.46%,差異顯著,這表明兩個(gè)基因缺失后菌株對(duì)抗血清殺傷作用的能力降低;互補(bǔ)lex-1后的菌株存活率與親本株相比無顯著差異,而ΔlgtB-c互補(bǔ)菌株的存活率降為8.51%,和親本株相比下降了約10倍,差異顯著。為了探討Δlgt B-c互補(bǔ)菌株血清敏感性升高的原因,運(yùn)用熒光定光PCR方法檢測(cè)lgtB的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔlgtB-c互補(bǔ)株中l(wèi)gtB的轉(zhuǎn)錄水平是親本株的27.05倍,說明lgt B基因在互補(bǔ)菌株中表達(dá)過量,這種對(duì)補(bǔ)體更為敏感的表型可能與lgtB過表達(dá)有關(guān)。副豬嗜血桿菌致病的重要機(jī)制之一是粘附和入侵宿主細(xì)胞。因此本研究測(cè)定了ΔlgtB和Δlex-1缺失株對(duì)豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)的粘附和入侵能力。結(jié)果表明和野生型菌株相比,ΔlgtB、Δlex-1缺失株的粘附和入侵能力都有顯著的下降,意味著lgtB/lex-1基因缺失后會(huì)導(dǎo)致菌株粘附入侵宿主細(xì)胞的能力下降。最后,本研究用ΔlgtB缺失株通過腹腔接種的方式感染250g左右健康普通級(jí)豚鼠,并與親本株SC096比較毒力差異。結(jié)果顯示感染SC096組豚鼠出現(xiàn)食欲、飲水量下降,精神不振,被毛粗亂、呼吸困難等臨床癥狀,但感染ΔlgtB缺失株組豚鼠無明顯臨床癥狀;感染SC096組豚鼠腹腔中有較多纖維素性滲出液,肝臟、胃,小腸表面都出現(xiàn)白色纖維素滲出,而感染ΔlgtB缺失株組豚鼠無明顯眼觀病理變化,腹腔內(nèi)沒有出現(xiàn)纖維素性滲出物。結(jié)果表明ΔlgtB缺失株與其親本株SC096相比,毒力有明顯減弱。
【關(guān)鍵詞】：副豬嗜血桿菌 lgtB lex-1 血清抗性 粘附 入侵 毒力
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 常用縮略詞（Abbreviation）8-13
• 1 前言13-20
• 1.1 副豬嗜血桿菌簡(jiǎn)介13
• 1.2 副豬嗜血桿菌致病機(jī)制研究進(jìn)展13-14
• 1.3 副豬嗜血桿菌致病相關(guān)因子14-18
• 1.3.1 莢膜與脂多糖在HPS致病過程中的作用14-16
• 1.3.2 外膜蛋白在HPS致病過程中的作用16-17
• 1.3.3 其他因子在HPS致病過程中的作用17-18
• 1.4 脂寡糖合成相關(guān)基因研究進(jìn)展18
• 1.5 Lgt B、lex-1 的相關(guān)研究18-19
• 1.6 研究目的和意義19-20
• 第一章 副豬嗜血桿菌lgt B、lex-1 基因缺失株及互補(bǔ)菌株的構(gòu)建20-34
• 1 材料與方法20-28
• 1.1 材料20-22
• 1.1.1 菌株和質(zhì)粒20
• 1.1.2 主要試劑20
• 1.1.3 溶液的配制20-21
• 1.1.4 主要儀器21
• 1.1.5 引物21-22
• 1.2 方法22-28
• 1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)和PCR模板的制備22
• 1.2.2 Lgt B和lex-1 基因缺失株的構(gòu)建22-25
• 1.2.2.1 Lgt B、lex-1 基因上臂和下臂的擴(kuò)增22-23
• 1.2.2.2 Lgt B、lex-1 上下臂的連接23-24
• 1.2.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化24-25
• 1.2.2.4 自然轉(zhuǎn)化SC096菌株25
• 1.2.3 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建25-28
• 1.2.3.1 PSF116中間載體的構(gòu)建25-26
• 1.2.3.2 互補(bǔ)載體p ZQ003和p ZQ004的構(gòu)建26-27
• 1.2.3.3 自然轉(zhuǎn)化 Δlgt B和 Δlex-1 菌株27-28
• 2 結(jié)果與分析28-32
• 2.1 缺失載體的構(gòu)建28-29
• 2.2 互補(bǔ)載體的構(gòu)建29-30
• 2.3 缺失株 Δlgt B、Δlex-1 和互補(bǔ)株 Δlgt B-c、Δlex1c的鑒定及分析30-32
• 3 討論32-33
• 4 結(jié)論33-34
• 第二章 副豬嗜血桿菌 Δlgt B和 Δlex-1 缺失株的致病特性研究34-49
• 1 材料與方法34-41
• 1.1 材料34-36
• 1.1.1 菌株34
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34
• 1.1.3 主要試劑34
• 1.1.4 溶液的配制34-35
• 1.1.5 主要儀器35-36
• 1.2 方法36-41
• 1.2.1 副豬嗜血桿菌的復(fù)壯及培養(yǎng)36
• 1.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定36
• 1.2.3 脂多糖的變化36-37
• 1.2.3.1 脂多糖的抽提36
• 1.2.3.2 SDS-PAGE36-37
• 1.2.3.3 銀染37
• 1.2.4 補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌試驗(yàn)37-38
• 1.2.5 PK-15 的粘附入侵38-40
• 1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)38
• 1.2.5.2 細(xì)胞粘附試驗(yàn)38
• 1.2.5.3 細(xì)胞入侵試驗(yàn)38-39
• 1.2.5.4 Real-Time PCR 檢測(cè) lgtB 轉(zhuǎn)錄水平39-40
• 1.2.6 豚鼠感染試驗(yàn)40
• 1.2.6.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)40
• 1.2.6.2 感染豚鼠40
• 1.2.6.3 臨床癥狀、病理變化40
• 1.2.7 數(shù)據(jù)分析40-41
• 2 結(jié)果與分析41-45
• 2.1 野生型SC096和缺失菌株的生長(zhǎng)曲線的鑒定及分析41
• 2.2 脂寡糖的鑒定及分析41-42
• 2.3 血清殺菌試驗(yàn)的結(jié)果及分析42-43
• 2.4 粘附和入侵PK-15 細(xì)胞的能力43-44
• 2.5 豚鼠感染試驗(yàn)的結(jié)果及分析44-45
• 3 討論45-48
• 3.1 Lgt B、lex-1 基因缺失株的生長(zhǎng)曲線變化46
• 3.2 Lgt B、lex-1 基因缺失株的脂寡糖變化46-47
• 3.3 Lgt B、lex-1 基因缺失株的血清抗性47-48
• 3.4 Lgt B、lex-1 基因缺失菌株的粘附入侵能力48
• 3.5 Lgt B基因缺失株感染豚鼠結(jié)果分析48
• 4 結(jié)論48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-58
• 附錄 158-59
• 附錄 259-60
• 附錄 360

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 趙倩;湯承;楊發(fā)龍;邵國(guó)青;岳華;;副豬嗜血桿菌ompP2基因的結(jié)構(gòu)特征及其與毒力的聯(lián)系[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2010年06期

2 高鵬程;儲(chǔ)岳峰;趙萍;賀英;逯忠新;;豚鼠副豬嗜血桿菌感染動(dòng)物模型的建立[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年12期

3 高鵬程;儲(chǔ)岳峰;趙萍;賀英;逯忠新;;副豬嗜血桿菌感染豚鼠試驗(yàn)及在其體內(nèi)的分布[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年09期

  本文關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌lgtB和lex-1基因在脂寡糖合成及致病過程中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：446166