本文關鍵詞：雞NK細胞C-型凝集素樣受體蛋白BNK19的單抗制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自然殺傷(Natural killer,NK)細胞是哺乳動物以及其他脊椎動物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,具有抗腫瘤、抗病毒感染的作用。NK細胞發(fā)揮殺傷功能與活化性受體與抑制性受體介導的信號傳遞有關。近年來,雞NK細胞的研究也逐漸受到重視,研究的主要困難在于缺乏確定的NK細胞表面標志。b-nk基因編碼的BNK蛋白是表達于雞NK細胞表面的C型凝集素樣受體蛋白。BNK是高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白,胞質尾區(qū)有一個免疫受體酪氨酸抑制基序,與哺乳動物NK細胞受體結構相似,因此推測BNK蛋白是雞NK細胞的潛在受體。b-nk基因位于雞的主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex,MHC)核心區(qū)域,與MHC-B核心基因緊密連鎖。本研究利用國家禽類實驗動物種子中心保存的MHC單倍型雞BW/G1等6個品系,包括B19、B21等MHC-B單倍型,根據NCBI上公布的不同單倍型雞的b-nk基因序列,比較了單倍型雞的b-nk基因多態(tài)性,生物信息學分析結果與標準單倍型序列完全一致,表明可以利用b-nk基因進行MHC單倍型雞遺傳穩(wěn)定性監(jiān)測,同時也為后續(xù)實驗提供了實驗材料。以對多種疫病有較強敏感性的B19單倍型雞b-nk基因原核表達蛋白(BNK19)免疫小鼠,建立間接ELISA方法,篩選獲得一株單克隆抗體雜交瘤細胞株7A10,與原核表達的BNK21沒有Western Blot反應性,具有鑒別意義。截短表達分析結果表明,7A10針對表位在E149-S168之間。從B19單倍型雞外周血中分離淋巴細胞,刀豆素-A刺激后,提取細胞總RNA,RT-PCR方法擴增b-nk19基因,插入真核表達載體pIRES,成功構建真核表達載體pIRES-BNK19,轉染CHO細胞系,用G418加壓篩選獲得穩(wěn)定表達BNK19的細胞系。7A10單抗能夠通過Western Blot檢測到雞外周血淋巴細胞中BNK蛋白的表達。利用流式細胞儀檢測,7A10標記細胞占雞外周血淋巴細胞的16.7%。本實驗為BNK蛋白在雞NK細胞中的分子機制研究提供了基礎。
【關鍵詞】：BNK蛋白 自然殺傷細胞 單克隆抗體
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S831
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-19
• 1.1 研究的目的和意義12-15
• 1.1.1 NK細胞的功能12-13
• 1.1.2 NK細胞受體的位置及分類13-14
• 1.1.3 NK細胞受體結構與功能14-15
• 1.2 雞NK細胞15-19
• 1.2.1 雞NK細胞的鑒定15-16
• 1.2.2 雞NK細胞受體基因16-17
• 1.2.3 雞NK細胞受體17-19
• 第二章 MHC單倍型BW/Gn雞群的b-nk基因序列分析19-23
• 2.1 材料19
• 2.1.1 實驗動物19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 主要儀器19
• 2.2 方法19-20
• 2.2.1 b-nk基因序列分析19
• 2.2.2 序列分析19-20
• 2.3 結果20-21
• 2.3.1 b-nk基因測序結果20
• 2.3.2 b-nk氨基酸序列分析20-21
• 2.4 討論21-23
• 第三章 B19單倍型雞BNK單克隆抗體的制備23-30
• 3.1 材料23
• 3.1.1 實驗動物23
• 3.1.2 主要試劑23
• 3.1.3 主要儀器23
• 3.2 方法23-27
• 3.2.1 BNK19蛋白的純化23-24
• 3.2.2 動物免疫24
• 3.2.3 間接ELISA方法的建立24
• 3.2.4 細胞融合24-25
• 3.2.5 間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞25
• 3.2.6 雜交瘤細胞的亞克隆、凍存和復蘇25-26
• 3.2.7 雜交瘤細胞腹水的制備及純化26
• 3.2.8 單克隆抗體的亞型鑒定及腹水效價26
• 3.2.9 單克隆抗體腹水的Western Blot檢測26
• 3.2.10 單抗表位的鑒定26-27
• 3.3 結果27-29
• 3.3.1 BNK19原核表達蛋白純化結果27-28
• 3.3.2 間接ELISA方法的建立28
• 3.3.3 單抗亞型鑒定及腹水效價測定28
• 3.3.4 腹水的Western blot檢測28
• 3.3.5 7A10單抗表位的初步鑒定28-29
• 3.4 討論29-30
• 第四章 穩(wěn)定表達B19單倍型雞BNK蛋白的細胞系構建30-36
• 4.1 材料30
• 4.1.1 生物材料30
• 4.1.2 主要試劑30
• 4.1.3 主要儀器30
• 4.2 方法30-32
• 4.2.1 b-nk19基因的引物設計30
• 4.2.2 b-nk19基因mRNA的提取及擴增30-31
• 4.2.3 pIRES-BNK19真核表達載體的構建31
• 4.2.4 pIRES-BNK19真核表達細胞系的建立31-32
• 4.2.5 BNK19蛋白表達細胞系的RT-PCR鑒定32
• 4.2.6 BNK19蛋白表達細胞系的IFA鑒定32
• 4.2.7 BNK19蛋白表達細胞系的Western Bolt鑒定32
• 4.2.8 CHO-BNK19穩(wěn)定表達細胞系的建立32
• 4.3 結果32-35
• 4.3.1 pIRES-BNK19重組質粒的構建32-33
• 4.3.2 表達BNK19蛋白瞬時細胞系的建立33
• 4.3.3 細胞系的RT-PCR鑒定33-34
• 4.3.4 IFA鑒定34
• 4.3.5 Western Bolt鑒定34-35
• 4.3.6 CHO-BNK19穩(wěn)定表達細胞系的建立35
• 4.4 討論35-36
• 第五章 雞不同組織淋巴細胞中BNK蛋白的表達36-40
• 5.1 材料36
• 5.1.1 生物材料36
• 5.1.2 主要試劑36
• 5.1.3 主要儀器36
• 5.2 方法36-37
• 5.2.1 BNK蛋白在雞胚脾臟淋巴細胞的表達36-37
• 5.2.2 BNK蛋白在外周血淋巴細胞的表達37
• 5.3 結果37-38
• 5.3.1 BNK蛋白在雞胚脾臟淋巴細胞中表達37-38
• 5.3.2 BNK蛋白在外周血淋巴細胞中表達38
• 5.4 討論38-40
• 第六章 全文結論40-41
• 參考文獻41-48
• 致謝48-49
• 作者簡歷49

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1 吳少蓮;雞NK細胞C-型凝集素樣受體蛋白BNK19的單抗制備[D];中國農業(yè)科學院;2016年

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本文編號：441607