本文關(guān)鍵詞：利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究FHL3基因?qū)Σ煌±w維類型形成的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肌肉是由不同類型的肌纖維構(gòu)成,根據(jù)肌球蛋白重鏈的不同可將肌纖維類型分為I型、IIa型、IIb型和IIx型等四種。四種不同肌纖維在肌肉中所占比例的變化影響著肌肉的品質(zhì),因此研究不同肌纖維類型之間的轉(zhuǎn)化對改良肌肉的品質(zhì)具有重要意義。FHL3蛋白是LIM蛋白家族一員,本課題組前期研究表明在C2C12成肌細(xì)胞中超表達(dá)FHL3基因可抑制MyHC I基因的表達(dá),促進(jìn)MyHC IIa和MyHC IIb基因的表達(dá),但在活體水平FHL3基因?qū)Σ煌±w維類型的影響仍不清楚。本研究以肌肉超表達(dá)FHL3轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,在活體水平上驗證了該基因?qū)Σ煌±w維類型形成的影響。具體研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了pEGFP-N1L-MCK-FHL3肌肉特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體,利用PCR技術(shù)成功篩選獲得FHL3陽性轉(zhuǎn)基因小鼠,采用Q-PCR法和熱不對稱交錯式PCR法檢測了F0、F1代陽性小鼠外源FHL3基因拷貝數(shù)及F0代51號小鼠FHL3基因的插入位點,結(jié)果表明外源基因FHL3是以連續(xù)多個拷貝的方式插入小鼠基因組內(nèi),且51號個體FHL3基因插入在小鼠4號染色體內(nèi)。2.統(tǒng)計了F0代小鼠窩產(chǎn)仔數(shù)、F1代小鼠陽性率以及生長曲線,結(jié)果表明F0代轉(zhuǎn)基因母鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)顯著高于野生母鼠,F0代轉(zhuǎn)基因公鼠所產(chǎn)后代陽性率顯著低于F0代轉(zhuǎn)基因母鼠所產(chǎn)后代的陽性率,2-8周齡轉(zhuǎn)FHL3基因公鼠和母鼠的體重與野生公鼠和母鼠的體重?zé)o顯著差異。3.利用Q-PCR方法檢測了FHL3基因在2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和野生小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、小腸、胃、脂肪、肌肉、睪丸等組織中的表達(dá)量,結(jié)果表明轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的心肌、骨骼肌、睪丸中,FHL3基因的mRNA表達(dá)量顯著高于野生鼠。4.對2月齡小鼠股四頭肌進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色,利用Image J軟件對股四頭肌肌纖維數(shù)目和橫截面積分別進(jìn)行統(tǒng)計,統(tǒng)計結(jié)果顯示轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的肌纖維數(shù)目和橫截面積與野生鼠相比均無顯著差異。5.提取2月齡轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠和野生小鼠腓腸肌組織的RNA和蛋白,利用Q-PCR和Western blotting技術(shù)分別檢測了FHL3、MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIb等基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠中FHL3、MyHC IIa、MyHC IIb基因的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于野生鼠,MyHC I基因的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于野生鼠。6.利用ATP酶染色和SDH染色區(qū)分2月齡小鼠比目魚肌和股四頭肌中的不同肌纖維類型,與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠I型纖維顯著降低,II型纖維顯著上升。綜上所述,本研究利用轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠模型,驗證了FHL3可負(fù)調(diào)控MyHC I基因的表達(dá),正調(diào)控My HC IIa和MyHC IIb基因的表達(dá),從而導(dǎo)致I型肌纖維降低,II型肌纖維增多。本研究在活體水平上闡明了FHL3基因?qū)Σ煌±w維類型的影響,為改善動物肉質(zhì)品質(zhì)提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：FHL3 轉(zhuǎn)基因小鼠 肌纖維類型 MyHC
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 縮略詞表12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1 骨骼肌肌纖維的分類、特征及對肉質(zhì)的影響13-16
• 1.1 骨骼肌肌纖維的分類13-14
• 1.2 骨骼肌肌纖維不同類型的特征14-15
• 1.3 骨骼肌不同肌纖維類型對肉質(zhì)的影響15-16
• 2 調(diào)控肌纖維類型的信號通路16-19
• 2.1 胰島素樣生長因子（IGFS）信號通路17
• 2.2 鈣調(diào)磷酸酶-活性T細(xì)胞核因子（CaN-NFAT）信號通路17-18
• 2.3 生肌調(diào)節(jié)因子（MRFS）途徑18-19
• 3 FHL3家族的研究進(jìn)展19-22
• 3.1 LIM蛋白的分類和功能19-20
• 3.2 FHL家族成員及特點20-21
• 3.3 FHL3的功能及其調(diào)控機制21-22
• 4 轉(zhuǎn)基因動物的研究進(jìn)展及制備方法22-24
• 5 研究的目的和意義24-25
• 第二章 材料和方法25-47
• 1 試驗材料25-30
• 1.1 試驗樣品25
• 1.2 主要儀器和設(shè)備25-27
• 1.3 主要試劑與試劑盒27-28
• 1.4 常用試劑及配制28-29
• 1.5 應(yīng)用的生物信息學(xué)網(wǎng)站及分析軟件29-30
• 1.6 所用載體30
• 2 試驗方法30-47
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.1.1 細(xì)胞的復(fù)蘇30-31
• 2.1.2 C2C12細(xì)胞的增殖培養(yǎng)31
• 2.1.3 C2C12細(xì)胞的分化培養(yǎng)31
• 2.1.4 細(xì)胞的凍存31
• 2.2 FHL3轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建31-36
• 2.2.1 總RNA的提取和cDNA的制備31-33
• 2.2.2 小鼠FHL3 cDNA的克隆33-34
• 2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳和成像34
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物的膠回收和克隆測序34-35
• 2.2.5 質(zhì)粒提取35
• 2.2.6 pEGFP-N1L-MCK-FHL3轉(zhuǎn)基因載體的酶切鑒定35-36
• 2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的飼養(yǎng)36
• 2.4 鼠尾DNA提取36-37
• 2.5 Quantitative real-time PCR分析37-38
• 2.6 轉(zhuǎn)基因小鼠絕對定量拷貝數(shù)檢測38-39
• 2.7 轉(zhuǎn)基因小鼠插入位點檢測39-41
• 2.7.1 熱不對稱交錯式PCR及引物序列39-40
• 2.7.2 瓊脂糖凝膠電泳和成像40
• 2.7.3 PCR產(chǎn)物的膠回收和克隆測序40
• 2.7.4 外源基因插入位點驗證40-41
• 2.7.5 瓊脂糖凝膠電泳和成像41
• 2.8 Western blotting分析41-44
• 2.8.1 蛋白提取41-42
• 2.8.2 BCA蛋白濃度測定42
• 2.8.3 SDS-PAGE電泳42-43
• 2.8.4 轉(zhuǎn)膜43
• 2.8.5 封閉43
• 2.8.6 免疫反應(yīng)43
• 2.8.7 ECL化學(xué)發(fā)光檢測43-44
• 2.9 轉(zhuǎn)基因小鼠的形態(tài)學(xué)檢測44-47
• 2.9.1 轉(zhuǎn)基因小鼠組織樣品的采取44
• 2.9.2 石蠟切片的制作44
• 2.9.3 HE染色44-45
• 2.9.4 骨骼肌冰凍切片及ATP酶染色45
• 2.9.5 琥珀酸脫氫酶染色45-47
• 第三章 研究結(jié)果與分析47-59
• 1. 構(gòu)建肌肉特異表達(dá)FHL3基因的轉(zhuǎn)基因載體47-48
• 2. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠傳代以及PCR檢測篩選48
• 3. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠遺傳性能及體重的變化48-50
• 4. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠睪丸組織形態(tài)的變化50-51
• 5. 外源基因拷貝數(shù)檢測51-52
• 6. 外源基因插入位點的研究52-54
• 7. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的組織表達(dá)譜54
• 8. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠肌肉HE染色54-55
• 9. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠中不同肌纖維類型的變化55-58
• 10.轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠不同肌纖維類型的形態(tài)學(xué)鑒定58-59
• 第四章 討論59-63
• 1. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的拷貝數(shù)、插入位點研究59-60
• 2. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠繁殖性狀的研究60-61
• 3. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠肌纖維數(shù)目和橫截面積的變化61
• 4. 轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠中不同肌纖維類型的變化61-63
• 第五章 小結(jié)63-64
• 1. 主要研究結(jié)果63
• 2. 下一步工作計劃63-64
• 參考文獻(xiàn)64-79
• 在讀期間發(fā)表的文章79-80
• 致謝80

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