本文關(guān)鍵詞：犬瘟熱病毒SH株的分離鑒定及其感染性克隆的構(gòu)建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬科及其他食肉目動(dòng)物等多種動(dòng)物的急性、高度接觸性傳染病。死亡率高達(dá)80%,對(duì)當(dāng)前的養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)及野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害。目前,我國(guó)CDV野生型毒株的反向遺傳技術(shù)平臺(tái)還不完善,限制著CDV在宿主動(dòng)物體內(nèi)擴(kuò)散分布及其分子致病機(jī)制的研究。因此,構(gòu)建CDV的感染性克隆以研究當(dāng)前流行犬瘟熱野毒株的特性具有重要的意義。方法:(1)將自然感染的患病犬病料按照1:10比例研磨,過(guò)濾后接種穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM受體的BHK-SLAM細(xì)胞,于感染后48-60h收集細(xì)胞毒繼續(xù)傳代,傳至第三代時(shí)對(duì)收集的細(xì)胞提取RNA,以RT-PCR方法檢測(cè)病毒,同時(shí)測(cè)定病毒滴度。最終大量擴(kuò)增病毒,以差速離心法純化,使用電子顯微鏡鑒定病毒;(2)采用RT-PCR技術(shù)從自然感染的患病犬病料中克隆出CDV全基因組序列及其H基因序列,利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)全基因組序列進(jìn)行拼接并分析,擴(kuò)增的H基因命名為CDV-H,拼接的全基因組序列命名為CDV-SH株;(3)采用PCR方法擴(kuò)增CDV N基因,擴(kuò)增正確的片段克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,IPTG誘導(dǎo),表達(dá)重組N蛋白,并采用包涵體純化的方法純化重組蛋白。PCR擴(kuò)增得到1572bp的N基因片段,用純化的重組N蛋白免疫試驗(yàn)兔,制備N(xiāo)蛋白的多克隆抗體,用Western blot檢測(cè)其特異性;(4)根據(jù)CDV的全基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物,將CDV-SH株的全基因組分8個(gè)節(jié)段逐段插入PSK(+)載體,構(gòu)建pSK-CDV-SH重組質(zhì)粒;同時(shí)構(gòu)建并分別表達(dá)CDV-SH株N、P、L基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將上述4種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-SLAM細(xì)胞,培養(yǎng)72h后,收獲細(xì)胞培養(yǎng)物,再盲傳3代,用間接免疫熒光方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果:(1)分離了犬瘟熱病毒,并測(cè)定其最高病毒滴度為10-4.8;(2)克隆并拼接了CDV-SH的全基因組序列,克隆了CDV-SH的H基因序列,二者序列分析結(jié)果均表明CDV-SH毒株屬于亞洲1型;(3)表達(dá)了CDV N蛋白,并制備了特異性良好的多克隆抗體;(4)構(gòu)建了CDV強(qiáng)毒株CDV-SH的感染性克隆。結(jié)論:分離并鑒定了CDV強(qiáng)毒株SH毒株;制備了CDV N蛋白的特異性多克隆抗體;成功構(gòu)建了CDV-SH株的感染性克隆,為研究我國(guó)CDV的致病機(jī)理和遺傳變異等提供了良好技術(shù)平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：犬瘟熱 N基因 原核表達(dá) 全基因組 感染性克隆
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 犬瘟熱病毒的研究進(jìn)展12-20
• 1.1 前言12
• 1.2 犬瘟熱歷史12-13
• 1.3 犬瘟熱病毒的流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)理13-14
• 1.4 病毒的入侵和釋放14
• 1.5 核糖核蛋白復(fù)合體RNP的形成14-15
• 1.6 病毒粒子的轉(zhuǎn)錄15-16
• 1.7 基因組的復(fù)制16
• 1.8 麻疹病毒屬病毒基因組16-18
• 1.8.1 核衣殼蛋白N16-17
• 1.8.2 磷蛋白P17
• 1.8.3 半胱氨酸蛋白V及C蛋白開(kāi)放閱讀框17
• 1.8.4 基質(zhì)蛋白M17
• 1.8.5 融合蛋白F17-18
• 1.8.6 血凝素蛋白H18
• 1.8.7 大蛋白L18
• 1.9 犬瘟熱感染性克隆的研究18-20
• 第二章 犬瘟熱病毒的分離鑒定20-27
• 2.1 材料20
• 2.1.1 主要試劑20
• 2.1.2 病料與細(xì)胞20
• 2.2 方法20-23
• 2.2.1 病料處理20
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)20-21
• 2.2.3 病毒的分離培養(yǎng)21
• 2.2.4 病毒的鑒定21-23
• 2.3 結(jié)果23-26
• 2.3.1 試紙條快速檢測(cè)結(jié)果23
• 2.3.2 病毒分離結(jié)果23-24
• 2.3.3 RT-PCR鑒定結(jié)果24
• 2.3.4 病毒形態(tài)觀察24-25
• 2.3.5 病毒TCID50的測(cè)定25-26
• 2.4 討論26
• 2.5 結(jié)論26-27
• 第三章 犬瘟熱病毒全基因組序列及H基因的序列分析27-39
• 3.1 材料27
• 3.2 方法27-30
• 3.2.1 引物設(shè)計(jì)合成27-29
• 3.2.2 RNA抽提及RT-PCR擴(kuò)增29
• 3.2.3 目的基因的克隆和測(cè)序29
• 3.2.4 序列拼接29
• 3.2.5 序列結(jié)果分析29-30
• 3.3 結(jié)果30-37
• 3.3.1 不同基因組片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果30-31
• 3.3.2 H基因克隆初步鑒定結(jié)果31
• 3.3.3 基因測(cè)序結(jié)果分析31-34
• 3.3.4 基因遺傳進(jìn)化分析34-37
• 3.3.5 H基因的序列糖基化位點(diǎn)分析37
• 3.4 討論37-38
• 3.5 小結(jié)38-39
• 第四章 犬瘟熱病毒SH株N基因原核表達(dá)及多克隆抗體制備39-46
• 4.1 材料39
• 4.1.1 菌株與質(zhì)粒39
• 4.1.2 主要試劑39
• 4.2 方法39-41
• 4.2.1 CDV N基因的擴(kuò)增39-40
• 4.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定40
• 4.2.3 CDV N基因的誘導(dǎo)表達(dá)40
• 4.2.4 CDV N融合蛋白的純化與定量40-41
• 4.2.5 兔抗CDV N多克隆抗體的制備41
• 4.2.6 Western blot檢測(cè)多克隆抗體特異性41
• 4.2.7 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）41
• 4.3 結(jié)果41-44
• 4.3.1 目的基因的擴(kuò)增重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定41-42
• 4.3.2 CDV N蛋白表達(dá)42-43
• 4.3.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化與定量43
• 4.3.4 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）43-44
• 4.3.5 重組蛋白pET-32a-N多抗的鑒定44
• 4.4 討論44-45
• 4.5 小結(jié)45-46
• 第五章 犬瘟熱病毒CDV-SH株感染性克隆的構(gòu)建46-51
• 5.1 材料46-47
• 5.1.1 病毒株、細(xì)胞與質(zhì)粒46
• 5.1.2 主要試劑46-47
• 5.2 方法47-48
• 5.2.1 引物合成與設(shè)計(jì)47
• 5.2.2 CDV-SH感染性克隆及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建47-48
• 5.2.3 CDV-SH野毒株全長(zhǎng)cDNA感染性克隆初步鑒定48
• 5.3 結(jié)果48-49
• 5.3.1 CDV-SH野毒株全長(zhǎng)cDNA感染性克隆及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建48-49
• 5.3.2 間接免疫熒光檢測(cè)49
• 5.4 討論49-50
• 5.5 結(jié)論50-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 英文縮略表58-59
• 致謝59-60
• 作者簡(jiǎn)介60

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