本文關鍵詞：布魯氏菌胞內生存相關sRNA的篩選及非編碼小RNA BSR0441功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)是由布魯氏菌感染引起的一種危害嚴重的人獸共患傳染病。在世界各地廣泛流行,給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來嚴重危害。動物感染后出現流產或不育,對畜牧業(yè)帶來巨大損失；人感染主要由于食用或接觸了患病動物或畜產品污染所致,感染后表現為關節(jié)炎,心內膜炎和腦膜炎等。布魯氏菌為革蘭氏陰性菌、胞內寄生菌,主要寄生于單核細胞(常為巨噬細胞)內,在細胞內生存和復制是其主要毒力特征。細菌非編碼小RNA (small non-coding RNA, sRNA)是近年來在細菌中發(fā)現的一類RNA調控子,它們在應對環(huán)境變化的基因表達調控中扮演重要角色,是細菌代謝、毒力和適應環(huán)境壓力的重要調控子。作用方式主要是通過堿基互補配對與靶標基因mRNA結合,影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯,進而在轉錄水平上調控基因表達。本研究中,我們通過單鏈特異性深度測序篩選了布魯氏菌中的大量sRNA。選取30個與胞內生存相關的sRNA進行驗證,并利用RT-PCR驗證體外模擬細胞內環(huán)境刺激條件它們的轉錄情況。對其中一個涉及布魯氏菌毒力相關的sRNA即BSR0441進行研究,并對BSR0441的靶基因進行了預測和驗證,分析了BSR0441在布魯氏菌胞內生存中的作用。首先,標準培養(yǎng)條件下體外培養(yǎng)布魯氏菌16M株,提取總RNA，純化mRNA后利用dUTP第二鏈標記方法制備cDNA文庫,PCR擴增后進行單鏈特異性測序,以16M基因組序列為參照對測序得到的reads進行比對,分析鑒定所有的sRNA。結果表明,reads在基因組上的覆蓋度良好,總共識別了1321個sRNA,長度在100到600 nt間。這些sRNA在布魯氏菌染色體中的分布不同,同時它們的轉錄水平也存在差異。RT-PCR結果顯示,預測的sRNA在體外條件下都存在轉錄,且與布魯氏菌胞內生存相關。運用TargetRNA2預測sRNA的靶基因,BSR0441的靶基因主要為布魯氏菌毒力相關的轉錄調控因子。為了驗證測序結果的正確性,首先利用Northern blot確認BSR0441在布魯氏菌中存在轉錄。qRT-PCR分析BSR0441在布魯氏菌體外不同生長期及感染情況下的轉錄,結果顯示其在布魯氏菌不同生長期和小鼠感染期間都存在轉錄。為進一步探討B(tài)SR0441在布魯氏菌胞內生存和毒力中的作用,構建了BSR0441的突變株(16M-△BSR0441)和過表達株(16M-BSR0441)，并對野生株(16M)、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的相關表型進行研究。生長曲線結果表明,BSR0441對布魯氏菌的生長速度影響較小。在模擬巨噬細胞內環(huán)境的多種體外刺激條件下的生存能力結果表明,BSR0441缺失或過表達后在各種刺激條件的存活率降低、抵抗壓力的能力下降,尤其在熱應激和酸刺激下胞內存活率明顯下降。巨噬細胞侵染試驗結果表明,BSR0441缺失與過表達使布魯氏菌在細胞感染期間的存活能力下降。小鼠毒力試驗結果顯示,感染中后期突變株的數量較野生株明顯減少,表明BSR0441參與調控布魯氏菌在體內的生存和繁殖。為進一步了解BSR0441在布魯氏菌中的作用,我們對其靶基因進行了預測,并采用qRT-PCR分析16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441對5個靶基因的轉錄水平的影響。結果表明,在巨噬細胞和小鼠感染期間BSR0441的缺失與過表達影響了其靶基因的轉錄,且該sRNA同時調控多個靶基因。
【關鍵詞】：布魯氏菌 sRNA 單鏈特異性深度測序 毒力 胞內生存
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-12
• 第一章 文獻綜述12-22
• 1 布魯氏菌病的危害及其病原學特征12-13
• 2 布魯氏菌的致病機理13-15
• 3 細菌sRNA的分類和功能15-17
• 4 細菌sRNA的篩選、鑒定及靶基因的預測17-20
• 4.1 細菌sRNA的篩選與鑒定方法17-19
• 4.2 sRNA靶基因的生物信息學預測19-20
• 5 布魯氏菌sRNA的研究現狀20-21
• 6 本研究的目的意義21-22
• 第二章 布魯氏菌胞內生存相關sRNA的篩選22-36
• 1 材料22-24
• 1.1 菌株及培養(yǎng)基22-23
• 1.2 主要試劑23
• 1.3 試驗儀器23
• 1.4 引物23-24
• 2 方法24-27
• 2.1 布魯氏菌sRNA的篩選24-25
• 2.2 不同刺激條件下布魯氏菌sRNA的RT-PCR鑒定25-26
• 2.2.1 提取不同體外刺激條件下16M總RNA25-26
• 2.2.2 Dnase Ⅰ處理26
• 2.2.3 cDNA第一鏈的合成26
• 2.2.4 RT-PCR鑒定26
• 2.3 布魯氏菌sRNA靶基因的預測26-27
• 3 結果與分析27-33
• 3.1 布魯氏菌sRNA的篩選27-29
• 3.1.1 16M轉錄組的測序數據分析27-28
• 3.1.2 候選sRNA的特征28-29
• 3.2 體外刺激條件下16M sRNA的RT-PCR鑒定29-31
• 3.3 布魯氏菌sRNA(Candidate_1069)靶基因的預測31-33
• 4 討論33-36
• 4.1 布魯氏菌sRNA的篩選33-35
• 4.2 布魯氏菌sRNA的RT-PCR驗證35
• 4.3 布魯氏菌sRNA(Candidae_1069)靶基因的預測35-36
• 第三章 布魯氏菌非編碼小RNA BSR0441功能的初步研究36-60
• 1 材料36-39
• 1.1 菌株、細胞系、載體及培養(yǎng)基36
• 1.2 試驗動物36-37
• 1.3 主要試劑37
• 1.4 試驗儀器37-38
• 1.5 引物38-39
• 2 方法39-45
• 2.1 BSR0441的Northern Blot驗證39-40
• 2.1.1 DIG-BSR0441探針的制備39
• 2.1.2 Northern Blot驗證39-40
• 2.2 BSR0441在體外以及體內的轉錄分析40-41
• 2.2.1 BSR0441在體外不同生長時期的轉錄40
• 2.2.2 BSR0441在細胞內的轉錄40-41
• 2.2.3 BSR0441在小鼠體內的轉錄41
• 2.3 BSR0441突變株和過表達株的構建41-44
• 2.3.1 BSR0441突變株的構建41-43
• 2.3.2 BSR0441過表達株的構建43
• 2.3.3 BSR0441突變株和過表達株的RT-PCR驗證43-44
• 2.4 BSR0441突變株和過表達株的表型分析44-45
• 2.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生長曲線測定44
• 2.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的體外應激試驗44
• 2.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的細胞侵染試驗44
• 2.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力試驗44-45
• 2.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析45
• 2.5.1 細胞內靶標基因的qRT-PCR45
• 2.5.2 小鼠體內靶標基因的qRT-PCR45
• 3 結果與分析45-56
• 3.1 BSR0441的Northern Blot驗證45-46
• 3.2 BSR0441的轉錄分析46-48
• 3.2.1 BSR0441在體外不同生長時期的轉錄46
• 3.2.2 BSR0441在細胞內的轉錄46-47
• 3.2.3 BSR0441在小鼠體內的轉錄47-48
• 3.3 BSR0441突變株和過表達株的構建48-51
• 3.3.1 BSR0441突變株的構建與鑒定48-49
• 3.3.2 BSR0441過表達株的構建與鑒定49-50
• 3.3.3 BSR0441突變株和過表達株的RT-PCR驗證50-51
• 3.4 BSR0441突變株和過表達株的表型分析51-53
• 3.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生長曲線51
• 3.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的體外應激試驗51-52
• 3.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的細胞侵染試驗52-53
• 3.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力試驗53
• 3.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析53-56
• 3.5.1 感染細胞期間BSR0441對靶標基因的作用54-55
• 3.5.2 體內感染情況下BSR0441對靶標基因的作用55-56
• 4 討論56-60
• 4.1 BSR0441的驗證56-57
• 4.2 BSR0441突變株和過表達株的構建57-58
• 4.3 BSR0441相關毒力表型分析58
• 4.4 BSR0441對其靶基因的調控作用58-60
• 結論60-61
• 參考文獻61-69
• 致謝69-70
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文70-71

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前8條

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  本文關鍵詞：布魯氏菌胞內生存相關sRNA的篩選及非編碼小RNA BSR0441功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：437380