本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌胞內(nèi)生存相關(guān)sRNA的篩選及非編碼小RNA BSR0441功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,簡(jiǎn)稱(chēng)布病)是由布魯氏菌感染引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病。在世界各地廣泛流行,給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重危害。動(dòng)物感染后出現(xiàn)流產(chǎn)或不育,對(duì)畜牧業(yè)帶來(lái)巨大損失；人感染主要由于食用或接觸了患病動(dòng)物或畜產(chǎn)品污染所致,感染后表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎,心內(nèi)膜炎和腦膜炎等。布魯氏菌為革蘭氏陰性菌、胞內(nèi)寄生菌,主要寄生于單核細(xì)胞(常為巨噬細(xì)胞)內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)生存和復(fù)制是其主要毒力特征。細(xì)菌非編碼小RNA (small non-coding RNA, sRNA)是近年來(lái)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)RNA調(diào)控子,它們?cè)趹?yīng)對(duì)環(huán)境變化的基因表達(dá)調(diào)控中扮演重要角色,是細(xì)菌代謝、毒力和適應(yīng)環(huán)境壓力的重要調(diào)控子。作用方式主要是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶標(biāo)基因mRNA結(jié)合,影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯,進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)。本研究中,我們通過(guò)單鏈特異性深度測(cè)序篩選了布魯氏菌中的大量sRNA。選取30個(gè)與胞內(nèi)生存相關(guān)的sRNA進(jìn)行驗(yàn)證,并利用RT-PCR驗(yàn)證體外模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境刺激條件它們的轉(zhuǎn)錄情況。對(duì)其中一個(gè)涉及布魯氏菌毒力相關(guān)的sRNA即BSR0441進(jìn)行研究,并對(duì)BSR0441的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)和驗(yàn)證,分析了BSR0441在布魯氏菌胞內(nèi)生存中的作用。首先,標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下體外培養(yǎng)布魯氏菌16M株,提取總RNA，純化mRNA后利用dUTP第二鏈標(biāo)記方法制備cDNA文庫(kù),PCR擴(kuò)增后進(jìn)行單鏈特異性測(cè)序,以16M基因組序列為參照對(duì)測(cè)序得到的reads進(jìn)行比對(duì),分析鑒定所有的sRNA。結(jié)果表明,reads在基因組上的覆蓋度良好,總共識(shí)別了1321個(gè)sRNA,長(zhǎng)度在100到600 nt間。這些sRNA在布魯氏菌染色體中的分布不同,同時(shí)它們的轉(zhuǎn)錄水平也存在差異。RT-PCR結(jié)果顯示,預(yù)測(cè)的sRNA在體外條件下都存在轉(zhuǎn)錄,且與布魯氏菌胞內(nèi)生存相關(guān)。運(yùn)用TargetRNA2預(yù)測(cè)sRNA的靶基因,BSR0441的靶基因主要為布魯氏菌毒力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的正確性,首先利用Northern blot確認(rèn)BSR0441在布魯氏菌中存在轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR分析BSR0441在布魯氏菌體外不同生長(zhǎng)期及感染情況下的轉(zhuǎn)錄,結(jié)果顯示其在布魯氏菌不同生長(zhǎng)期和小鼠感染期間都存在轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步探討B(tài)SR0441在布魯氏菌胞內(nèi)生存和毒力中的作用,構(gòu)建了BSR0441的突變株(16M-△BSR0441)和過(guò)表達(dá)株(16M-BSR0441)，并對(duì)野生株(16M)、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的相關(guān)表型進(jìn)行研究。生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果表明,BSR0441對(duì)布魯氏菌的生長(zhǎng)速度影響較小。在模擬巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的多種體外刺激條件下的生存能力結(jié)果表明,BSR0441缺失或過(guò)表達(dá)后在各種刺激條件的存活率降低、抵抗壓力的能力下降,尤其在熱應(yīng)激和酸刺激下胞內(nèi)存活率明顯下降。巨噬細(xì)胞侵染試驗(yàn)結(jié)果表明,BSR0441缺失與過(guò)表達(dá)使布魯氏菌在細(xì)胞感染期間的存活能力下降。小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示,感染中后期突變株的數(shù)量較野生株明顯減少,表明BSR0441參與調(diào)控布魯氏菌在體內(nèi)的生存和繁殖。為進(jìn)一步了解BSR0441在布魯氏菌中的作用,我們對(duì)其靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),并采用qRT-PCR分析16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441對(duì)5個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果表明,在巨噬細(xì)胞和小鼠感染期間BSR0441的缺失與過(guò)表達(dá)影響了其靶基因的轉(zhuǎn)錄,且該sRNA同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 sRNA 單鏈特異性深度測(cè)序 毒力 胞內(nèi)生存
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1 布魯氏菌病的危害及其病原學(xué)特征12-13
• 2 布魯氏菌的致病機(jī)理13-15
• 3 細(xì)菌sRNA的分類(lèi)和功能15-17
• 4 細(xì)菌sRNA的篩選、鑒定及靶基因的預(yù)測(cè)17-20
• 4.1 細(xì)菌sRNA的篩選與鑒定方法17-19
• 4.2 sRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)19-20
• 5 布魯氏菌sRNA的研究現(xiàn)狀20-21
• 6 本研究的目的意義21-22
• 第二章 布魯氏菌胞內(nèi)生存相關(guān)sRNA的篩選22-36
• 1 材料22-24
• 1.1 菌株及培養(yǎng)基22-23
• 1.2 主要試劑23
• 1.3 試驗(yàn)儀器23
• 1.4 引物23-24
• 2 方法24-27
• 2.1 布魯氏菌sRNA的篩選24-25
• 2.2 不同刺激條件下布魯氏菌sRNA的RT-PCR鑒定25-26
• 2.2.1 提取不同體外刺激條件下16M總RNA25-26
• 2.2.2 Dnase Ⅰ處理26
• 2.2.3 cDNA第一鏈的合成26
• 2.2.4 RT-PCR鑒定26
• 2.3 布魯氏菌sRNA靶基因的預(yù)測(cè)26-27
• 3 結(jié)果與分析27-33
• 3.1 布魯氏菌sRNA的篩選27-29
• 3.1.1 16M轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序數(shù)據(jù)分析27-28
• 3.1.2 候選sRNA的特征28-29
• 3.2 體外刺激條件下16M sRNA的RT-PCR鑒定29-31
• 3.3 布魯氏菌sRNA(Candidate_1069)靶基因的預(yù)測(cè)31-33
• 4 討論33-36
• 4.1 布魯氏菌sRNA的篩選33-35
• 4.2 布魯氏菌sRNA的RT-PCR驗(yàn)證35
• 4.3 布魯氏菌sRNA(Candidae_1069)靶基因的預(yù)測(cè)35-36
• 第三章 布魯氏菌非編碼小RNA BSR0441功能的初步研究36-60
• 1 材料36-39
• 1.1 菌株、細(xì)胞系、載體及培養(yǎng)基36
• 1.2 試驗(yàn)動(dòng)物36-37
• 1.3 主要試劑37
• 1.4 試驗(yàn)儀器37-38
• 1.5 引物38-39
• 2 方法39-45
• 2.1 BSR0441的Northern Blot驗(yàn)證39-40
• 2.1.1 DIG-BSR0441探針的制備39
• 2.1.2 Northern Blot驗(yàn)證39-40
• 2.2 BSR0441在體外以及體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄分析40-41
• 2.2.1 BSR0441在體外不同生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄40
• 2.2.2 BSR0441在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄40-41
• 2.2.3 BSR0441在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄41
• 2.3 BSR0441突變株和過(guò)表達(dá)株的構(gòu)建41-44
• 2.3.1 BSR0441突變株的構(gòu)建41-43
• 2.3.2 BSR0441過(guò)表達(dá)株的構(gòu)建43
• 2.3.3 BSR0441突變株和過(guò)表達(dá)株的RT-PCR驗(yàn)證43-44
• 2.4 BSR0441突變株和過(guò)表達(dá)株的表型分析44-45
• 2.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定44
• 2.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的體外應(yīng)激試驗(yàn)44
• 2.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的細(xì)胞侵染試驗(yàn)44
• 2.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力試驗(yàn)44-45
• 2.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析45
• 2.5.1 細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)基因的qRT-PCR45
• 2.5.2 小鼠體內(nèi)靶標(biāo)基因的qRT-PCR45
• 3 結(jié)果與分析45-56
• 3.1 BSR0441的Northern Blot驗(yàn)證45-46
• 3.2 BSR0441的轉(zhuǎn)錄分析46-48
• 3.2.1 BSR0441在體外不同生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄46
• 3.2.2 BSR0441在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄46-47
• 3.2.3 BSR0441在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄47-48
• 3.3 BSR0441突變株和過(guò)表達(dá)株的構(gòu)建48-51
• 3.3.1 BSR0441突變株的構(gòu)建與鑒定48-49
• 3.3.2 BSR0441過(guò)表達(dá)株的構(gòu)建與鑒定49-50
• 3.3.3 BSR0441突變株和過(guò)表達(dá)株的RT-PCR驗(yàn)證50-51
• 3.4 BSR0441突變株和過(guò)表達(dá)株的表型分析51-53
• 3.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生長(zhǎng)曲線(xiàn)51
• 3.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的體外應(yīng)激試驗(yàn)51-52
• 3.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的細(xì)胞侵染試驗(yàn)52-53
• 3.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力試驗(yàn)53
• 3.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析53-56
• 3.5.1 感染細(xì)胞期間BSR0441對(duì)靶標(biāo)基因的作用54-55
• 3.5.2 體內(nèi)感染情況下BSR0441對(duì)靶標(biāo)基因的作用55-56
• 4 討論56-60
• 4.1 BSR0441的驗(yàn)證56-57
• 4.2 BSR0441突變株和過(guò)表達(dá)株的構(gòu)建57-58
• 4.3 BSR0441相關(guān)毒力表型分析58
• 4.4 BSR0441對(duì)其靶基因的調(diào)控作用58-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 致謝69-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文70-71

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌胞內(nèi)生存相關(guān)sRNA的篩選及非編碼小RNA BSR0441功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：437380