發(fā)布時間：2017-06-08 20:17

  本文關鍵詞：表面展示豬流感病毒NS1乳酸菌pSIP409-pgsA-NS1的制備及其免疫作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬流感在世界范圍內廣泛流行,帶來了巨大危害和經濟損失。如何研制出安全有效的豬流感口服制劑(疫苗)是科研工作者共同要解決的難題。乳酸菌作為一種腸道益生菌不僅具有免疫調節(jié)功能,還可作為表達外源蛋白的載體。但由于其所表達的外源蛋白大多在胞內,所以在一定程度上限制了外源蛋白在胞外發(fā)揮作用。pgs A是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)多聚谷氨酸合成酶系統(tǒng)PGA的組成部分,它可以將外源蛋白穩(wěn)定地錨定在菌體表面,促進其在胞外發(fā)揮作用。本實驗選用植物乳桿菌作為外源蛋白的遞呈載體,將pgs A表面展示元件與豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)主要保護性抗原NS1基因進行融合構建新功能型乳酸菌,并對其免疫效果進行評價和分析。本實驗的研究內容及結果如下:(1)新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-NS1的構建及蛋白表達通過基因工程方法構建重組質粒p SIP409-pgs A-NS1,并電轉入植物乳桿菌中。重組菌經誘導肽誘導表達后,通過SDS-PAGE、BCA、Western blotting檢測表達蛋白的大小、濃度和免疫反應原性。通過FCM和IF檢測植物乳桿菌菌體表面的熒光強度來判定NS1蛋白的錨定和表達情況。實驗結果表明:成功構建了新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-NS1,SDS-PAGE驗證表達蛋白大小符合預期,BCA測定蛋白濃度為0.11146 mg/m L,Western blotting驗證表達蛋白的免疫反應原性良好,FCM和IF在菌體表面檢測出較強的熒光信號,表明pgs A成功地將NS1蛋白錨定在菌體表面。為下一步新功能型乳酸菌免疫動物以及攻毒實驗奠定基礎。(2)新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-NS1免疫保護效果的檢測按免疫程序將新功能型乳酸菌喂飼小鼠。免疫結束后,通過MTS法檢測小鼠脾臟淋巴細胞的增殖情況。ELISA方法檢測小鼠體內NS1特異性Ig G和SIg A的含量。流式細胞術檢測各免疫器官中T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化情況。攻毒后監(jiān)控小鼠體重,計算體重丟失率及存活率。制作小鼠肺部病理切片,計算肺指數和肺指數抑制率。ELISA方法檢測攻毒前后小鼠血清中細胞因子的分泌情況。實驗結果顯示:新功能型乳酸菌可以有效刺激脾臟淋巴細胞增殖,提高小鼠體內NS1特異性Ig G和SIg A的水平,促進小鼠各免疫器官中T淋巴細胞和B淋巴細胞活化。攻毒后新功能型乳酸菌組小鼠體重丟失少且恢復快,存活率也明顯高于其它對照組。肺指數、肺指數抑制率以及肺部病理切片表明:新功能型乳酸菌能緩解攻毒后小鼠肺部的炎性病變,降低肺部的病理損傷,可在一定程度上預防豬流感病毒的感染。綜上所述,p SIP409-pgs A-NS1新功能型乳酸菌構建表達成功。pgs A可作為一種錨定基因可以將NS1蛋白穩(wěn)定地錨定在植物乳桿菌菌體表面,促進其在胞外發(fā)揮作用。該菌還可刺激小鼠脾臟淋巴細胞的增殖,以及NS1特異性Ig G和SIg A抗體的分泌,增強B淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的活化,提高機體的體液免疫和細胞免疫水平,增強機體免疫力,為抗豬流感口服微生態(tài)制劑的研制提供了依據。
【關鍵詞】：豬流感病毒 新功能型乳酸菌 NS1 pgsA
【學位授予單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S859.79
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-11
• 第一篇 文獻綜述11-18
• 第一章 豬流感的研究進展11-13
• 1.1 豬流感的流行現狀11
• 1.2 豬流感疫苗的研究進展11-13
• 第二章 流感病毒非結構蛋白NS1的研究進展13-16
• 2.1 NS基因及其編碼蛋白13
• 2.2 NS1蛋白的結構13
• 2.3 甲型流感病毒非結構蛋白NS1的功能13-16
• 第三章 乳酸菌表面展示元件研究進展16-17
• 3.1 微生物表面展示技術概述16
• 3.2 pgsA蛋白的研究進展16-17
• 第四章 植物乳桿菌應用研究進展17-18
• 4.1 植物乳桿菌概述17
• 4.2 植物乳桿菌應用的研究進展17-18
• 第二篇 研究內容18-54
• 第一章 pSIP409-pgsA-NS1新功能型乳酸菌的構建及表達18-36
• 1 材料18-19
• 2 方法19-24
• 3 結果24-34
• 4 討論34
• 5 小結34-36
• 第二章 pSIP409-pgsA-NS1新功能型乳酸菌免疫保護效果的研究36-54
• 1 材料36
• 2 方法36-38
• 3 結果38-52
• 4 討論52-53
• 5 小結53-54
• 結論54-55
• 參考文獻55-61
• 附錄61-69
• 縮略語表（Abbreviation）69-70
• 作者簡介70-71
• 致謝71

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