本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒E2蛋白納米抗體的篩選及活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種以嚴(yán)重出血和高熱為特征的高度接觸性傳染病。豬瘟可導(dǎo)致豬群大規(guī)模發(fā)病和死亡,流行于世界許多國家,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失,并且嚴(yán)重威脅豬相關(guān)產(chǎn)品貿(mào)易,是危害養(yǎng)豬業(yè)最主要的傳染病之一,被世界動物衛(wèi)生組織列為法定報告疫病。CSFV在分類上屬于黃病毒科瘟病毒屬,其基因組由一條單股正鏈RNA組成,長約12 kb,編碼一個多聚蛋白前體,此多聚蛋白在宿主細(xì)胞和病毒自身蛋白酶的作用下,可裂解和加工為12種成熟蛋白,其中C、Erns、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白,其余8種均為非結(jié)構(gòu)蛋白。E2蛋白位于成熟病毒粒子的囊膜上,不僅與病毒吸附和入侵宿主有密切關(guān)系,而且也是誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生免疫保護(hù)的最主要抗原蛋白。因此,E2蛋白是設(shè)計和開發(fā)抗CSFV疫苗、診斷試劑的理想靶標(biāo)。雖然已有多株E2蛋白的單克隆抗體被篩選出來,并且在診斷領(lǐng)域得到了應(yīng)用,但是目前仍未見CSFV E2蛋白納米抗體的報道,并且常規(guī)單克隆抗體的制造成本較高,為降低診斷治療試劑的成本以及為CSFV研究提供新的工具,開發(fā)新的廉價抗CSFV抗體很有必要。納米抗體(Nanobodies,Nbs)衍生于駱駝體內(nèi)存在的重鏈抗體,是目前已知天然存在的最小抗體片段。由于納米抗體相對較長的CDR3區(qū)以及FR2區(qū)特征性親水性氨基酸的存在,使其在具備分子量小的優(yōu)勢的同時,又兼具高親和力、高可溶性、容易制造和表達(dá)、且可識別常規(guī)抗體不能識別的表位等優(yōu)點,是診斷和治療性生物試劑設(shè)計的理想候選體。本研究以E2蛋白為誘餌,利用酵母雙雜交技術(shù)對前期實驗室構(gòu)建的納米抗體文庫進(jìn)行了篩選,并對篩選出的納米抗體進(jìn)行了表達(dá)和初步的活性鑒定。主要內(nèi)容如下:(1)根據(jù)GenBank中公布的CSFV C株序列,設(shè)計引物擴(kuò)增出缺失跨膜區(qū)E2基因,成功構(gòu)建pGBKT7-E2誘餌質(zhì)粒,并對質(zhì)粒的自激活活性和毒性進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明E2蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)無毒性和自激活能力,可用于酵母雙雜交的篩選。利用此誘餌對納米抗體酵母雙雜交文庫進(jìn)行篩選后,成功獲得8株陽性克隆。(2)將篩選的陽性克隆序列克隆至原核表達(dá)載體pET28a-SUMO,構(gòu)建了納米抗體原核表達(dá)載體;對納米抗體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件,結(jié)果顯示納米抗體在30℃、IPTG濃度為0.6 mmol/L下誘導(dǎo)8 h表達(dá)量最佳;同時也構(gòu)建了E2蛋白的原核表達(dá)載體pMal-c2X-E2,轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞后,成功誘導(dǎo)表達(dá)和純化了E2蛋白。(3)通過間接ELISA、Western Blot和Dot Blot對表達(dá)純化的納米抗體活性進(jìn)行了初步的鑒定。ELISA結(jié)果表明篩選出的納米抗體可與CSFV反應(yīng),且反應(yīng)活性顯著高于陰性對照(P0.05)。Western Blot和Dot Blot結(jié)果顯示表達(dá)純化的8株納米抗體可特異性地與E2蛋白反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 納米抗體 酵母雙雜交 E2蛋白
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 文獻(xiàn)綜述11-25
• 第一章 緒論11-25
• 1.1 豬瘟病毒研究進(jìn)展11-15
• 1.1.1 豬瘟病毒的形態(tài)及理化特性11-12
• 1.1.2 CSFV基因組12
• 1.1.3 豬瘟病毒致病機(jī)理12-13
• 1.1.4 豬瘟病毒E2蛋白13-14
• 1.1.5 豬瘟病毒的防治14-15
• 1.2 納米抗體的研究進(jìn)展15-20
• 1.2.1 納米抗體的發(fā)現(xiàn)16
• 1.2.2 納米抗體結(jié)構(gòu)16-18
• 1.2.3 納米抗體特點18-19
• 1.2.4 納米抗體的應(yīng)用19-20
• 1.3 酵母雙雜交系統(tǒng)20-24
• 1.3.1 酵母雙雜交系統(tǒng)20-21
• 1.3.2 文庫篩選方法21-22
• 1.3.3 酵母雙雜技系統(tǒng)的應(yīng)用22-23
• 1.3.4 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)缺點23-24
• 1.4 本研究目的意義24-25
• 試驗研究25-47
• 第二章 CSFV E2蛋白納米抗體的篩選25-33
• 2.1 材料25
• 2.2 方法25-28
• 2.2.1 pGBKT7-E2誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建25-27
• 2.2.2 誘餌質(zhì)粒的毒性及自激活鑒定27
• 2.2.3 文庫篩選27-28
• 2.3 結(jié)果與分析28-30
• 2.3.1 重組誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建28
• 2.3.2 誘餌質(zhì)粒的毒性及自激活鑒定28-29
• 2.3.3 文庫篩選29
• 2.3.4 序列分析29-30
• 2.4 討論30-32
• 2.5 小結(jié)32-33
• 第三章 CSFV E2蛋白及其納米抗體的原核表達(dá)與純化33-43
• 3.1 材料33
• 3.2 方法33-37
• 3.2.1 CSFV E2蛋白的表達(dá)及純化33-35
• 3.2.2 納米抗體的表達(dá)與純化35-37
• 3.3 結(jié)果與分析37-41
• 3.3.1 pMal-c2X-E2重組表達(dá)載體的構(gòu)建37-38
• 3.3.2 E2蛋白的表達(dá)與純化38
• 3.3.3 pET28a-SUMO-VHH重組表達(dá)載體的構(gòu)建38-39
• 3.3.4 VHH的表達(dá)及其表達(dá)條件的優(yōu)化39-41
• 3.3.5 VHH的純化41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結(jié)42-43
• 第四章 CSFV E2蛋白納米抗體活性檢測43-47
• 4.1 材料43
• 4.2 方法43-44
• 4.2.1 間接ELISA43
• 4.2.2 Western blot43-44
• 4.2.3 Dot blot44
• 4.3 結(jié)果44-46
• 4.3.1 間接ELISA44-45
• 4.3.2 Western blot45
• 4.3.3 Dot blot45-46
• 4.4 討論46
• 4.5 小結(jié)46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 附錄55-59
• 致謝59-60
• 作者簡介60

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