本文關(guān)鍵詞：MiR-127-3p在C2C12成肌細胞增殖和分化的作用及調(diào)控機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Micro RNAs(miRNAs)是一類小非編碼RNA,其在骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本文首先建立了山羊miR-127-3p的組織表達譜,分析了其在不同肌肉表型的山羊品種間組織表達差異,初步明確了miR-127-3p與骨骼肌表型的關(guān)系。其次,應(yīng)用miR-127-3p的慢病毒載體(mimic和inhibitor)分別轉(zhuǎn)染處于增殖、分化階段的C2C12細胞,qPCR法檢測了培養(yǎng)第3天和第5天C2C12細胞內(nèi)肌源性標(biāo)記基因MyoD,MyoG和Myosin的動態(tài)表達,并對C2C12細胞組織形態(tài)學(xué)進行了檢測分析,對miR-127-3p的生肌效應(yīng)進行了體外實驗驗證分析。為闡明miR-127-3p生肌調(diào)控機理,構(gòu)建了miR-127-3p靶基因熒光素酶報告載體,通過熒光素酶報告載體系統(tǒng)驗證了Vamp2和Sept7是miR-127-3p的靶基因,揭示了miR-127-3p對成肌細胞增殖和分化的作用機制。主要結(jié)果如下:1、miR-127-3p是一個在山羊組織中廣泛表達的miRNA;miR-127-3p在波爾山羊和巫山黑山羊中的肌肉,脾,心和皮膚組織中高表達,而在肺,腎和肝組織中表達量低,特別是miR-127-3p在波爾山羊肌肉組織中的表達量高于巫山黑山羊。2、miR-127-3p的表達隨著成肌細胞的增殖呈增加的趨勢,第5天達到最高;在C2C12細胞轉(zhuǎn)染miR-127-3p mimic的第3天和第5天:與對照組相比,肌源性標(biāo)記基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表達降低,肌細胞增殖減慢;干擾miR-127-3p后,肌源性標(biāo)記基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表達升高,肌細胞增殖加快。3、miR-127-3p的表達隨著C2C12細胞分化逐漸增加,第5天達到最高值;進行誘導(dǎo)分化的第3天和第5天:與對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-127-3p mimic的成肌細胞的融合指數(shù)(或分化指數(shù))增加,生肌分化標(biāo)記基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表達升高。干擾miR-127-3p后,肌管的形成減少,成肌細胞融合指數(shù)和(或)分化指數(shù)降低,生肌分化標(biāo)記基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表達降低。4、構(gòu)建了候選靶基因Vamp2和Sept7的熒光素酶報告載體并與miR-127-3p mimic共轉(zhuǎn)了293T細胞,發(fā)現(xiàn)miR-127-3p可高效結(jié)合Vamp2和Sept7的3′UTR端序列。隨后將miR-127-3p的慢病毒載體(mimic和inhibitor)分別轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-127-3p可高效抑制Vamp2和Sept7的表達。這表明miR-127-3p是通過調(diào)控靶基因Vamp2和Sept7的表達來影響C2C12細胞的增殖、分化進程的。
【關(guān)鍵詞】：miR-127-3p C2C12細胞 山羊 生肌調(diào)控 靶基因
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 論文部分縮寫詞的中英文對照3-4
• 摘要4-6
• SUMMARY6-11
• 第一章 文獻綜述11-23
• 1 肌肉發(fā)育與形成機制11-16
• 1.1 肌肉的形成及發(fā)育11-12
• 1.2 骨骼肌發(fā)生過程中的生肌調(diào)控因子12-16
• 1.2.1 生肌調(diào)控因子（myogenic regulatory factors，MRFS）12-13
• 1.2.2 成肌細胞增強因子 2（Myocyte enhancer factor2，，MEF2）13-14
• 1.2.3 Pax基因 (Paired box，Pax)14-15
• 1.2.4 肌肉生長抑制因子 (Myostatin，MSTN)15-16
• 2 miRNA生物學(xué)特征16-22
• 2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)16
• 2.2 miRNA的生成16-17
• 2.3 miRNA的作用機制17-18
• 2.4 miRNA與骨骼肌發(fā)育的關(guān)系18-20
• 2.5 miRNA調(diào)控肌纖維類型20-21
• 2.6 miR1273p的研究現(xiàn)狀21-22
• 3 研究目的及意義22-23
• 第二章 試驗研究23-64
• 試驗一 miR1273p保守性及組織表達分析23-30
• 1 材料與方法23-27
• 1.1 試驗材料23-24
• 1.1.1 組織樣品23
• 1.1.2 儀器設(shè)備23-24
• 1.1.3 試劑耗材24
• 1.2 方法24-27
• 1.2.1 組織樣品采集24
• 1.2.2 總RNA的提取及檢測24-25
• 1.2.3 RNA的質(zhì)量檢測25-26
• 1.2.4 RT-qPCR檢測miR1273p的表達26-27
• 2 結(jié)果與分析27-28
• 2.1 miR1273p序列的同源性分析27
• 2.2 miR1273p在不同山羊品種間的組織表達譜27-28
• 3 討論28-30
• 試驗二 miR1273p對C2C12成肌細胞增殖和分化的作用30-50
• 1 材料與方法30-35
• 1.1 試驗材料30-31
• 1.1.1 細胞系30
• 1.1.2 儀器設(shè)備30-31
• 1.1.3 試劑耗材31
• 1.2 方法31-35
• 1.2.1 C2C12細胞培養(yǎng)31-32
• 1.2.2 miR1273p模擬物/抑制劑轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞32
• 1.2.3 融合指數(shù)和分化指數(shù)計數(shù)32
• 1.2.4 RT-qPCR檢測miR1273p的表達32-33
• 1.2.5 RT-qPCR檢測肌源性標(biāo)記基因mRNA的變化33-35
• 2 結(jié)果與分析35-48
• 2.1 miR1273p對C2C12成肌細胞增殖的影響35-41
• 2.1.1 miR1273p在C2C12成肌細胞增殖過程中的動態(tài)變化35-36
• 2.1.2 過表達miR1273p抑制C2C12成肌細胞增殖36-39
• 2.1.3 干擾miR1273p促進C2C12成肌細胞增殖39-41
• 2.2 miR1273p對C2C12成肌細胞分化的影響41-48
• 2.2.1 miR1273p在C2C12成肌細胞分化不同時期的動態(tài)變化41-42
• 2.2.2 過表達miR1273p促進C2C12細胞成肌分化42-45
• 2.2.3 干擾miR1273p抑制C2C12細胞生肌分化45-48
• 3 討論48-50
• 試驗三 miR1273p的靶基因分析與鑒定50-64
• 1 材料與方法51-59
• 1.1 試驗材料51-53
• 1.1.1 細胞系51
• 1.1.2 菌株及載體51-52
• 1.1.3 儀器設(shè)備52
• 1.1.4 試劑耗材52
• 1.1.5 常用溶液配制52-53
• 1.1.6 分子生物學(xué)相關(guān)軟件53
• 1.2 方法53-59
• 1.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測miR1273p靶基因53-54
• 1.2.2 靶基因野生型和突變型的 3′UTR的擴增54
• 1.2.3 靶基因野生型和突變型的 3′UTR片段膠回收54-55
• 1.2.4 靶基因野生型和突變型的 3′UTR片段雙酶切55-56
• 1.2.5 靶基因野生型和突變型的 3′UTR片段連接56
• 1.2.6 靶基因野生型和突變型的 3′UTR片段轉(zhuǎn)化56-57
• 1.2.7 質(zhì)粒的提取57-58
• 1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測試驗58-59
• 2 結(jié)果與分析59-62
• 2.1 利用軟件預(yù)測miR1273p的靶基因59
• 2.2 miR1273p抑制其靶基因熒光素酶活性59-60
• 2.3 miR1273p抑制其靶基因mRNA的表達60-62
• 3 討論62-64
• 結(jié)論64-65
• 本研究獲得的結(jié)果64
• 本研究的創(chuàng)新點與特色64-65
• 參考文獻65-74
• 致謝74-75
• 個人簡介75-76
• 導(dǎo)師簡介76-77

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本文編號：406808