本文關(guān)鍵詞：VSV誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡的主導(dǎo)蛋白及其互作蛋白的鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)是彈狀病毒科水皰病毒屬的一員,主要引起豬、馬、牛及一些野生動物發(fā)生水皰性口炎。VSV感染動物后,其特征性的臨床癥狀為舌、唇、頰黏膜、乳頭、蹄冠出現(xiàn)水皰,水皰易破裂,露出肉芽組織,呈紅色糜爛。人接觸該病毒后偶然發(fā)病,表現(xiàn)為流感樣癥狀,出現(xiàn)短期發(fā)熱、怕冷、頭痛、惡心、肌肉痛、無力等癥狀。該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)的動物疫病。VSV除引起嚴(yán)重的口炎外,其對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷逐漸被研究人員所重視。與其它的嗜神經(jīng)病毒相似,VSV感染后可以沿著軸突順行或逆行傳播,主要引起中樞神經(jīng)的損傷。通過對小鼠腦部接種該病毒可快速引起神經(jīng)細(xì)胞變性壞死及單核細(xì)胞浸潤,而鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞損傷與凋亡密切相關(guān)。M蛋白是VSV的一種結(jié)構(gòu)蛋白,作為一種重要的毒力因子,在VSV誘導(dǎo)疾病發(fā)生發(fā)展的過程中至關(guān)重要。對其它易感細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),其不僅誘導(dǎo)病毒的聚集過程,引起已感染VSV的細(xì)胞發(fā)生病變,而且參與VSV誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過程和對宿主細(xì)胞的抗病毒免疫。但M蛋白在VSV侵嗜神經(jīng)過程中的作用尚不清楚目前。為此,本論文開展了以下研究工作。VSV可在小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a細(xì)胞)上復(fù)制增殖且感染細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇VSV感染的N2a細(xì)胞為感染模型,首先通過形態(tài)學(xué)的觀察、PCR鑒定、Hochest染色、DNA Ladder及流式細(xì)胞術(shù)檢測VSV感染N2a細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果表明,VSV可以引起N2a細(xì)胞的凋亡。然后,分別構(gòu)建VSV-M、VSV-G和VSV-P的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染后檢測細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染VSV-M蛋白后細(xì)胞的凋亡率高于另外兩者。由此可見,VSV-M蛋白是誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡的主導(dǎo)蛋白之一。以VSV-M作為誘餌,構(gòu)建其誘餌表達(dá)載體,進(jìn)行其互作蛋白的篩選鑒定。應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)將構(gòu)建的VSV-M誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞中,檢測誘餌質(zhì)粒對酵母細(xì)胞的毒性及自激活作用。檢測結(jié)果表明可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),將誘餌質(zhì)粒與鼠腦c DNA文庫進(jìn)行雜交融合,通過在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上多次篩選后初步獲得一些陽性克隆。提取陽性克隆的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,再提取質(zhì)粒后,應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定,然后將陽性的質(zhì)粒測序,測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析后,初步確定一些與VSV-M蛋白相互作用的蛋白,如羧基肽酶-E、HAX-1。HAX-1(HS1-associated protein X-1,HS1相關(guān)蛋白X-1)是一種可以與絲氨酸/酪氨酸激酶的底物HS1(hematopoietic cell specific Lyn substrate1)相互作用的蛋白質(zhì),分子量為35 k Da,由HAX-1基因編碼,可以與多種蛋白發(fā)生相互作用。HAX-1可能參與B細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體介導(dǎo)的凋亡及增殖反應(yīng)等多種不同生物學(xué)作用。近年來對HAX-1的研究越來越多,但還未見在VSV感染方面的研究。為了驗(yàn)證所篩選的蛋白與VSV-M蛋白間可能存在相互作用,我們首先進(jìn)行了酵母雙雜交回轉(zhuǎn)雜交試驗(yàn),然后通過PCR技術(shù)獲得HAX-1基因,構(gòu)建其真核表達(dá)載體,同時(shí)構(gòu)建VSV-M原核表達(dá)載體,以制備其多克隆抗體為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。之后進(jìn)行GST Pull-down及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證兩者相互作用的特異性。將構(gòu)建的VSV-M及HAX-1蛋白的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染,利用激光共聚焦顯微鏡觀察確定兩者的共定位現(xiàn)象。VSV-M與HAX-1的相互作用為在分子水平上探索M蛋白新功能奠定一定的基礎(chǔ),并為進(jìn)一步研究VSV的致病機(jī)制提供一定的幫助。綜上所述,本研究證實(shí)VSV可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,為深入解析VSV致神經(jīng)損傷的分子機(jī)制補(bǔ)充更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：VSV-M 細(xì)胞凋亡 酵母雙雜交 HAX-1
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮略詞表11-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-29
• 第一章 水皰性口炎病毒基質(zhì)蛋白研究進(jìn)展13-18
• 1.1 水皰性口炎病毒的分子特征13-14
• 1.2 水皰性口炎病毒基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)特性14-15
• 1.3 水皰性口炎病毒與細(xì)胞凋亡15-18
• 第二章 宿主蛋白HAX-1 的研究現(xiàn)狀18-24
• 2.1 HAX-1 蛋白概述18-20
• 2.2 HAX-1 的生物學(xué)功能20-24
• 第三章 酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展24-29
• 3.1 酵母雙雜交技術(shù)原理24-25
• 3.2 酵母雙雜交的應(yīng)用25-27
• 3.3 酵母雙雜交的優(yōu)缺點(diǎn)27-28
• 3.4 展望28-29
• 第二篇 研究內(nèi)容29-70
• 第一章 VSV誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的病毒主導(dǎo)蛋白確證29-41
• 1.1 材料29-30
• 1.2 方法30-35
• 1.3 結(jié)果35-39
• 1.4 討論39-40
• 1.5 小結(jié)40-41
• 第二章 水皰性口炎病毒M蛋白互作宿主蛋白的篩選41-55
• 2.1 材料41-42
• 2.2 方法42-48
• 2.3 結(jié)果48-53
• 2.4 討論53-54
• 2.5 小結(jié)54-55
• 第三章 VSV-M蛋白和宿主蛋白HAX-1 相互作用的鑒定55-70
• 3.1 材料55-56
• 3.2 方法56-60
• 3.3 結(jié)果60-67
• 3.4 討論67-69
• 3.5 小結(jié)69-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-81
• 導(dǎo)師簡介81-82
• 作者簡介及在攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文82-83
• 致謝83

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本文編號：405400