為簡(jiǎn)便、快速測(cè)定宿主體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌的活菌數(shù),本研究以布魯氏菌單拷貝bcsp31基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo),設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件及疊氮溴化丙錠(PMA)最佳使用濃度與曝光時(shí)間,建立了一種測(cè)定布魯氏菌活菌數(shù)的疊氮溴化丙錠--熒光定量PCR方法(PMA-qPCR),并評(píng)估了該方法的特異性、敏感性、重復(fù)性。結(jié)果顯示,建立的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值之間線性關(guān)系良好;特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法對(duì)布魯氏菌S2株擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性,對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、副溶血弧菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性;其對(duì)布魯氏菌S2的檢測(cè)限為10～3cfu/mL,比常規(guī)PCR方法敏感性高100倍;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示,批間及批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均為0.63%～2.04%,重復(fù)性好。利用該方法對(duì)不同比例布魯氏菌S2活菌/死菌混合樣品定量測(cè)定,結(jié)果顯示隨活菌比例的增大,測(cè)得的活菌數(shù)與常規(guī)qPCR測(cè)定值越接近,表明經(jīng)優(yōu)化處理的PMA有效抑制了qPCR對(duì)死菌DNA的擴(kuò)增,但對(duì)活菌的qPCR擴(kuò)增無(wú)影響。將該方法與平板計(jì)數(shù)法共同測(cè)定TSB純培養(yǎng)的布魯氏菌S2活菌數(shù),結(jié)果二者的測(cè)定值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨后利用這兩種...

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【部分圖文】：

圖1 qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)PMA的最佳曝光時(shí)間、最適濃度進(jìn)行優(yōu)化。不同曝光時(shí)間結(jié)果顯示，隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，Ct值不斷增大，當(dāng)曝光時(shí)間≥10min時(shí)各個(gè)曝光時(shí)間點(diǎn)的Ct值均無(wú)顯著差異（p>0.05）（圖2A）；不同濃度PMA對(duì)熱致死菌作用的結(jié)果顯示，隨著PMA濃度的增大，擴(kuò)增的Ct值不斷增大，但當(dāng)濃度....

圖2 PMA處理?xiàng)l件的優(yōu)化結(jié)果

圖1qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.4特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 PMA-qPCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

以提取PMA處理過(guò)的大腸桿菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、副溶血弧菌、S2菌株的基因組為模板，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)RNase水為陰性對(duì)照，利用本研究建立的PMA-qPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，除了S2菌株與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品有特異性擴(kuò)增外，其余菌株及無(wú)RNase水均呈無(wú)擴(kuò)增（圖3....

圖4 PMA-qPCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

提取PMA處理過(guò)的S2菌株基因組，10倍倍比稀釋后作為模板，采用PMA-qP-CR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)菌液濃度在2.0×103cfu/mL～2.0×108cfu/mL范圍內(nèi)，布魯氏菌S2經(jīng)PMA處理（PMA-qPCR方法檢測(cè)）和未經(jīng)處理（常規(guī)qPCR檢測(cè)）的擴(kuò)增曲線基本吻合（圖3A....

本文編號(hào)：4042017