豬輪狀病毒（Porcine rotavirus, PoRV）是呼腸孤病毒科,輪狀病毒屬的成員,本屬病毒在世界范圍普遍流行,是流行廣泛的人獸共患病。目前,研制安全有效的疫苗是控制輪狀病毒感染的重要手段之一。本研究旨在對(duì)豬輪狀病毒VP7蛋白在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的表達(dá),并鑒定其免疫學(xué)特性。首先根據(jù)GenBank中發(fā)表的VP7全序列（NC₀11503.2）設(shè)計(jì)引物,從含VP7的G-2質(zhì)粒中擴(kuò)增目的片段,建立融合表達(dá)載體pESP-2-VP7的重組酵母工程菌。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-Dthiogalactoside, IPTG）可誘導(dǎo)表達(dá)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase, GST）-VP7融合蛋白,后將發(fā)酵工藝條件優(yōu)化后的融合蛋白GST-VP7分離純化并免疫小鼠（Mus musculus）,進(jìn)行免疫原性的分析。結(jié)果顯示,克隆的VP7基因與預(yù)計(jì)的糖蛋白基因大小一致,并在酵母菌中表達(dá)了分子質(zhì)量約61 k D重組蛋白,再經(jīng)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化后,獲得蛋白濃度達(dá)0.99 mg/...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 菌種與載體
    1.2 主要試劑
    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.4 擴(kuò)增目的片段
    1.5 重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
    1.6 VP7目的蛋白的誘導(dǎo)及表達(dá)
    1.7 碳源的選擇
    1.8 氮源的選擇
    1.9 適宜p H值的確定
    1.1 0 接種量
    1.1 1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定
    1.1 2 重組抗原VP7動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)
    1.1 3 抗體水平ELISA檢測(cè)
    1.1 4 中和抗體的檢測(cè)
    1.1 5 利用ELISPOT檢測(cè)分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴細(xì)胞數(shù)
    1.16數(shù)據(jù)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 VP7基因的克隆
    2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR、擴(kuò)增和酶切鑒定
    2.3 VP7蛋白的誘導(dǎo)及表達(dá)
    2.4 發(fā)酵碳源的優(yōu)化
    2.5 發(fā)酵氮源的優(yōu)化
    2.6 發(fā)酵p H值的優(yōu)化
    2.7 發(fā)酵工藝優(yōu)化后的蛋白含量測(cè)定
    2.8 VP7蛋白免疫小鼠血清Ig G抗體水平
    2.9 VP7蛋白免疫小鼠SIg A抗體水平及中和效價(jià)檢測(cè)
    2.1 0 ELISPOT計(jì)數(shù)分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴細(xì)胞
3 討論
4 結(jié)論



本文編號(hào)：4039089