A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng),尤其在肺部產(chǎn)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,其具體機(jī)制尚未明確。前期本實驗室有研究表明,流感病毒與Cullin-1相關(guān)的E3連接酶復(fù)合物(CRL1)之間存在互作,且與產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的NF-κB通路密切相關(guān)。本研究著眼于其他CRL復(fù)合體,尤其是CRL2復(fù)合體,研究其與流感病毒復(fù)制之間的關(guān)系,探究Cullin-2影響流感病毒感染宿主的分子調(diào)控機(jī)制,旨在為流感致病性機(jī)制研究提供新的思路。CRL復(fù)合物是作為E3連接酶中最大的家族,負(fù)責(zé)識別底物蛋白并將其泛素化。病毒作為一種結(jié)構(gòu)簡單的細(xì)胞寄生型生物,常常會利用宿主的CRL復(fù)合物,激活、劫持或干擾其底物的降解,創(chuàng)造有利病毒復(fù)制的環(huán)境。本研究通過分析A型流感病毒Ca09(H1N1)感染A549細(xì)胞6小時后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染后,cullin2、cullin5和CRL激活抑制分子CAND1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),這表明多種CRL相關(guān)基因可能在流感病毒感染早期發(fā)揮重要作用。為了研究CRL復(fù)合物對流感病毒復(fù)制以及對宿主細(xì)胞因子表達(dá)的影響,本研究根據(jù)8種Cullin蛋白...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 A型流感病毒的概述
        1.1.1 概述
        1.1.2 流感病毒感染宿主過程
        1.1.3 A型流感病毒的致病性
        1.1.4 流感病毒與天然免疫
    1.2 CRL復(fù)合體的概述
        1.2.1 概述
        1.2.2 CRL復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.3 CRL活性的的調(diào)節(jié)
        1.2.4 CRL與病毒感染
    1.3 CRL復(fù)合體與流感病毒關(guān)系
    1.4 研究目的與意義
第二章 Cullin-2 敲除細(xì)胞系的構(gòu)建及其對流感病毒復(fù)制的影響
    2.1 實驗材料
        2.1.1 流感病毒毒株、質(zhì)粒、細(xì)胞株
        2.1.2 實驗試劑及溶液配制
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 生物學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 流感病毒感染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
        2.2.2 敲除細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定
        2.2.3 流感病毒感染細(xì)胞實驗
        2.2.4 流感病毒滴度測定
        2.2.5 蛋白免疫印跡實驗
        2.2.6 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        2.2.7 實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子
        2.2.8 免疫共沉淀
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 流感病毒感染對CRL相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響
        2.3.2 CRL相關(guān)基因敲除載體構(gòu)建
        2.3.3 NAE1、Cullin-1/2/3的sg RNA敲除效果鑒定
        2.3.4 Cullin2 基因敲除細(xì)胞系鑒定
        2.3.5 TCID50 測定流感病毒感染KO細(xì)胞系的滴度
        2.3.6 Western blot檢測CUL2-KO細(xì)胞系的流感病毒蛋白表達(dá)
        2.3.7 實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)
        2.3.8 CO-IP驗證流感病毒相關(guān)蛋白與Cullin-2 蛋白的互作
    2.4 討論
第三章 Cullin-2 KO細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組學(xué)初步分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 實驗儀器
        3.1.4 生物學(xué)數(shù)據(jù)分析
    3.2 實驗方法
        3.2.1 Label Free實驗的樣品制備和全蛋白質(zhì)提取
        3.2.2 蛋白質(zhì)肽段水解
        3.2.3 LC-MS/MS分析液相色譜-質(zhì)譜分析
        3.2.4 蛋白質(zhì)鑒定和定量分析
        3.2.5 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 Cullin2 基因敲除引起蛋白質(zhì)的表達(dá)差異的鑒定與定量
        3.3.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO功能富集分析
        3.3.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)KEGG通路富集分析
        3.3.4 與CRL復(fù)合體和流感病毒相關(guān)的KEGG通路變化
    3.4 討論
第四章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號：4037910