A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染誘導機體產生過度炎癥反應,尤其在肺部產生“細胞因子風暴”,其具體機制尚未明確。前期本實驗室有研究表明,流感病毒與Cullin-1相關的E3連接酶復合物(CRL1)之間存在互作,且與產生炎性細胞因子的NF-κB通路密切相關。本研究著眼于其他CRL復合體,尤其是CRL2復合體,研究其與流感病毒復制之間的關系,探究Cullin-2影響流感病毒感染宿主的分子調控機制,旨在為流感致病性機制研究提供新的思路。CRL復合物是作為E3連接酶中最大的家族,負責識別底物蛋白并將其泛素化。病毒作為一種結構簡單的細胞寄生型生物,常常會利用宿主的CRL復合物,激活、劫持或干擾其底物的降解,創(chuàng)造有利病毒復制的環(huán)境。本研究通過分析A型流感病毒Ca09(H1N1)感染A549細胞6小時后的轉錄組學數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染后,cullin2、cullin5和CRL激活抑制分子CAND1基因的轉錄水平顯著下調,這表明多種CRL相關基因可能在流感病毒感染早期發(fā)揮重要作用。為了研究CRL復合物對流感病毒復制以及對宿主細胞因子表達的影響,本研究根據(jù)8種Cullin蛋白...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 A型流感病毒的概述
        1.1.1 概述
        1.1.2 流感病毒感染宿主過程
        1.1.3 A型流感病毒的致病性
        1.1.4 流感病毒與天然免疫
    1.2 CRL復合體的概述
        1.2.1 概述
        1.2.2 CRL復合體的結構與功能
        1.2.3 CRL活性的的調節(jié)
        1.2.4 CRL與病毒感染
    1.3 CRL復合體與流感病毒關系
    1.4 研究目的與意義
第二章 Cullin-2 敲除細胞系的構建及其對流感病毒復制的影響
    2.1 實驗材料
        2.1.1 流感病毒毒株、質粒、細胞株
        2.1.2 實驗試劑及溶液配制
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 生物學數(shù)據(jù)分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 流感病毒感染細胞轉錄組學分析
        2.2.2 敲除細胞系的構建與鑒定
        2.2.3 流感病毒感染細胞實驗
        2.2.4 流感病毒滴度測定
        2.2.5 蛋白免疫印跡實驗
        2.2.6 RNA提取和反轉錄
        2.2.7 實時熒光定量PCR檢測細胞因子
        2.2.8 免疫共沉淀
    2.3 實驗結果
        2.3.1 流感病毒感染對CRL相關基因轉錄組學的影響
        2.3.2 CRL相關基因敲除載體構建
        2.3.3 NAE1、Cullin-1/2/3的sg RNA敲除效果鑒定
        2.3.4 Cullin2 基因敲除細胞系鑒定
        2.3.5 TCID50 測定流感病毒感染KO細胞系的滴度
        2.3.6 Western blot檢測CUL2-KO細胞系的流感病毒蛋白表達
        2.3.7 實時熒光定量PCR檢測細胞因子轉錄表達
        2.3.8 CO-IP驗證流感病毒相關蛋白與Cullin-2 蛋白的互作
    2.4 討論
第三章 Cullin-2 KO細胞系的蛋白質組學初步分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞和質粒
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 實驗儀器
        3.1.4 生物學數(shù)據(jù)分析
    3.2 實驗方法
        3.2.1 Label Free實驗的樣品制備和全蛋白質提取
        3.2.2 蛋白質肽段水解
        3.2.3 LC-MS/MS分析液相色譜-質譜分析
        3.2.4 蛋白質鑒定和定量分析
        3.2.5 生物信息學數(shù)據(jù)分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 Cullin2 基因敲除引起蛋白質的表達差異的鑒定與定量
        3.3.2 差異表達蛋白質GO功能富集分析
        3.3.3 差異表達蛋白質KEGG通路富集分析
        3.3.4 與CRL復合體和流感病毒相關的KEGG通路變化
    3.4 討論
第四章 結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：4037910