早期斷奶引起的仔豬早期斷奶應激綜合癥是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的大事件，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。早期斷奶給仔豬造成的最明顯損傷就是導致仔豬腸道屏障功能損傷。有研究證實,細胞凋亡紊亂會導致腸黏膜屏障功能障礙和胃腸功能損傷，而自由基代謝異常與凋亡紊亂密切相關。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，早期斷奶會導致仔豬血清中H2O2和NO含量增加、抗氧化能力降低。但是斷奶導致的仔豬自由基代謝異常與腸細胞凋亡及腸屏障功能之間的關系仍未可知。 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC），作為一種強有效的抗氧化劑，已廣泛應用于臨床疾病治療研究，但對于其能否調(diào)控斷奶應激仔豬的自由基代謝和腸道細胞凋亡過程，減少腸道屏障損傷，緩解斷奶應激綜合癥及其機理還未見報道，為此，本文開展以下四個研究 1早期斷奶過程中仔豬腸道細胞凋亡研究 以酶學ELISA法分析Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，利用原位缺口末端標記、透射電鏡法觀察腸組織形態(tài)變化，并對凋亡相關基因（Caspase-3、8、9、Bcl-2和Bax基因）進行qRT-PCR表達分析，研究21日齡斷奶仔豬腸道細胞的凋亡過程，探...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
    1 細胞凋亡與腸道功能
        1.1 細胞凋亡的概念
        1.2 細胞凋亡機制
            1.2.1 半胱氨酸蛋白酶的激活與特性
            1.2.2 線粒體途徑
            1.2.3 死亡受體途徑
            1.2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑
        1.3 細胞凋亡與腸道功能的關系
            1.3.1 細胞凋亡與炎性腸病
            1.3.2 細胞凋亡與腸道癌癥
            1.3.3 細胞凋亡與缺血再灌注
    2 氧化應激與細胞凋亡
        2.1 氧化應激和自由基
            2.1.1 線粒體：細胞氧自由基產(chǎn)生的重要場所
            2.1.2 ROS 和氧化損傷
            2.1.3 線粒體：ROS 作用的靶點
        2.2 ROS 和細胞凋亡
            2.2.1 ROS 誘導細胞凋亡的機制
            2.2.2 ROS 和細胞色素 C 釋放機制
            2.2.3 心磷脂過氧化調(diào)控細胞色素 C 的釋放
        2.3 細胞 ROS、氧化還原和抗氧化防御系統(tǒng)
            2.3.1 抗氧化防御系統(tǒng)
            2.3.2 線粒體抗氧化防御系統(tǒng)
    3 腸道抗氧化生物學
        3.1 腸上皮的結構與功能
        3.2 小腸細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和抗氧化防御體系
            3.2.1 細胞氧化還原狀態(tài)的概念
            3.2.2 谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶系統(tǒng) (GSH/GSSG)
            3.2.3 硫氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)（Trx/TrxSS）
            3.2.4 半胱氨酸氧化還原系統(tǒng)(Cys/CySS)
        3.3 腸道氧化應激與腸道病理學
            3.3.1 腸道氧化應激與細胞的命運：增殖、分化、凋亡
            3.3.2 氧化應激、氧化還原狀態(tài)與腸道疾病
    4 氧化應激與抗氧化治療
        4.1 抗氧化治療與腸道疾病
        4.2 N-乙酰半胱氨酸——GSH 的前體物質(zhì)
        4.3 早期斷奶應激綜合癥
第一章 仔豬早期斷奶過程中腸道細胞凋亡研究
    1 材料與方法
        1.1 試驗設計
        1.2 腸組織 DNA Ladder 檢測
            1.2.1 試劑及儀器
            1.2.2 腸黏膜 DNA 提取
            1.2.3 電泳
        1.3 空腸組織中凋亡酶含量的測定
            1.3.1 試劑及儀器
            1.3.2 腸道組織勻漿中蛋白含量的測定
            1.3.3 Caspase-3 ELISA 檢測
            1.3.4 Caspase-8 ELISA 檢測
            1.3.5 Caspase-9 ELISA 檢測
        1.4 空腸腸組織 TUNEL 檢測
            1.4.1 實驗原理
            1.4.2 試劑
            1.4.3 設備
            1.4.4 組織包埋程序
            1.4.5 組織石蠟切片的制作
            1.4.6 腸組織 TUNEL 檢測
        1.5 腸細胞透射電鏡觀察
            1.5.1 原理
            1.5.2 試劑材料
            1.5.3 操作步驟
        1.6 腸組織凋亡相關基因實時熒光定量 PCR 檢測
            1.6.1 試劑及儀器
            1.6.2 總 RNA 的提取
            1.6.3 凋亡相關基因熒光定量 PCR
    2 結果與分析
        2.1 腸組織 DNA Ladder 檢測
        2.2 早期斷奶對仔豬空腸組織中凋亡酶含量的影響
        2.3 早期斷奶對仔豬空腸腸細胞凋亡的影響
        2.4 透射電鏡檢測早期斷奶對仔豬空腸腸細胞形態(tài)結構的影響
        2.5 凋亡相關基因實時熒光定量 PCR 檢測
    3 討論
        3.1 斷奶后仔豬腸細胞形態(tài)學變化
        3.2 斷奶后仔豬腸細胞凋亡分子機理研究
    4 小結
第二章 早期斷奶仔豬自由基代謝與腸細胞凋亡及腸屏障功能的關系
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗設計
            1.1.2 試驗藥品
            1.1.3 實驗儀器和設備
        1.2 血清抗氧化指標的測定
            1.2.1 血清中微量 MDA 含量的檢測方法
            1.2.2 血清中 SOD 活力的檢測方法
            1.2.3 血清中 GSH-Px 活力的檢測
            1.2.4 血清中 NO 含量測定
            1.2.5 血清中 H2O2的測定
            1.2.6 血清抑制羥自由基能力檢測
        1.3 酶聯(lián)免疫法檢測血清皮質(zhì)醇、低氧誘導因子及 TNF-α含量
            1.3.1 皮質(zhì)醇
            1.3.2 低氧誘導因子
            1.3.3 腫瘤壞死因子α
        1.4 腸黏膜通透性檢測
            1.4.1 血清 DAO 含量測定
            1.4.2 血清 IFABP 含量測定
        1.5 緊密連接相關基因熒光定量 PCR 檢測
            1.5.1 引物設計
            1.5.2 腸組織總 RNA 提取
            1.5.3 緊密連接相關基因熒光定量 PCR 檢測
        1.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結果與分析
        2.1 血清皮質(zhì)醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        2.2 血清 DAO 和 IFABP 測定
        2.3 血清抗氧化指標及自由基含量測定
        2.4 緊密連接相關基因熒光定量 PCR 檢測
        2.5 凋亡酶含量與抗氧化指標和自由基含量的相關性分析
    3 討論
        3.1 早期斷奶對仔豬血清皮質(zhì)醇、HIF-1α和 TNF-α含量的影響
        3.2 早期斷奶對仔豬血清 DAO 和 IFABP 含量的影響
        3.3 早期斷奶對仔豬血清抗氧化狀態(tài)的影響
        3.4 早期斷奶對仔豬腸黏膜緊密連接相關蛋白表達的影響
    4 小結
第三章 斷奶仔豬小腸基因表達譜及細胞凋亡代謝網(wǎng)絡分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料：
            1.1.1 實驗設計
            1.1.2 試劑及儀器
        1.2 RNA 抽提和純化
        1.3 芯片實驗
            1.3.1 樣品 RNA 的放大和標記
            1.3.2 芯片雜交
            1.3.3 芯片掃描
            1.3.4 芯片數(shù)據(jù)分析
        1.4 細胞周期及凋亡相關基因熒光定量 PCR 驗證
            1.4.1 引物設計
            1.4.2 熒光定量 PCR 檢測
            1.4.3 數(shù)據(jù)分析
    2 結果與分析
        2.1 RNA 樣品質(zhì)控
        2.2 芯片實驗質(zhì)控
            2.2.1 芯片檢出率檢測
            2.2.2 雜交信號均一性檢測
            2.2.3 芯片雜交火山圖
            2.2.4 芯片雜交箱線圖
            2.2.5 芯片雜交 PCA 圖分析
        2.3 差異表達基因篩選結果
        2.4 差異表達基因 heatmap 圖
        2.5 差異表達基因 GO 聚類分析
        2.6 差異表達基因 KEGG 代謝途徑分析
        2.7 細胞周期及凋亡相關基因實時熒光定量 PCR 驗證
        2.8 斷奶仔豬主要代謝調(diào)控網(wǎng)絡
        2.9 細胞周期代謝圖繪制
        2.10 免疫調(diào)控代謝圖繪制
    3. 討論
        3.1 斷奶后仔豬腸組織差異表達基因的篩選
        3.2 斷奶后仔豬腸細胞凋亡、增殖及細胞周期調(diào)控間的關系
        3.3 斷奶后仔豬腸 MAPK、JAK-STAT 途徑與細胞周期調(diào)控
    4 小結
第四章 N-乙酰半胱氨酸(NAC)對仔豬斷奶應激和腸道細胞凋亡的調(diào)控作用及其機理
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料：
            1.1.1 試驗設計
            1.1.2 試驗儀器
        1.2 血清皮質(zhì)醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        1.3 血清和肝臟抗氧化指標測定
            1.3.1 血清和肝臟 SOD 測定
            1.3.2 血清和肝臟 GSH-PX 活力測定
            1.3.3 血清和肝臟 MDA 含量測定
        1.4 空腸組織 HE 染色
            1.4.1 常規(guī)石蠟切片制作
            1.4.2 常規(guī)蘇木精-伊紅染色
        1.5 空腸組織 TUNEL 染色
        1.6 空腸組織透射電鏡檢測
        1.7 凋亡及細胞周期相關基因 mRNA 表達
    2 結果與分析
        2.1 血清皮質(zhì)醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        2.2 早期斷奶對仔豬血清和肝臟組織抗氧化能力的影響
        2.3 早期斷奶對仔豬空腸絨毛結構的影響
        2.4 腸組織 TUNEL 檢測
        2.5 腸細胞透射電鏡觀察
        2.6 細胞周期及凋亡相關基因實時熒光定量 PCR 檢測
    3 討論
        3.1 NAC 對斷奶仔豬抗氧化能力及應激狀態(tài)的影響
        3.2 NAC 對斷奶仔豬腸細胞凋亡及細胞周期調(diào)控
    4 小結
全文總結
參考文獻
附錄
文章部分縮略詞表
本文創(chuàng)新點及有待解決的問題
致謝
攻讀博士期間發(fā)表的論文



本文編號：4036165