發(fā)布時間：2024-12-07 00:29

　　體細胞核移植已有近20年的發(fā)展歷史，但其總效率仍然很低。目前認為是高度分化的體細胞在卵母細胞質(zhì)中重編程不完全，表觀遺傳修飾異常所致。本研究采用非洲爪蟾卵母細胞抽提物誘導(dǎo)和牛胎兒成纖維細胞重編程，使其恢復(fù)到一個較低的分化狀態(tài)；并以發(fā)生重編程的細胞為核供體進行體細胞核移植，研究其對總效率的影響。 1.爪蟾卵母細胞抽提物的提取 通過超數(shù)排卵獲得爪蟾卵母細胞，10000rpm離心獲得M期爪蟾卵母細胞抽提物，蛋白含量分析顯示，三次提取的抽提物蛋白濃度均為25-35μg/μL。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，三次提取抽提物所包含蛋白種類一致，成功建立爪蟾卵母細胞抽提物提取體系。 2.抽提物誘導(dǎo)供體細胞的重編程 本研究采集40日齡和牛胎兒的皮膚組織，采用組織塊貼壁法建立和牛胎兒成纖維細胞系。通過繪制細胞生長曲線和分析染色體核型，結(jié)果顯示該細胞系在3-6d細胞處于對數(shù)生長期，染色體倍型正常（2n=60）說明細胞系具有良好的生長狀態(tài)。 應(yīng)用細胞膜透化劑digitonin對獲得的和牛胎兒成纖維細胞進行通透處理，篩選出透化劑最適濃度為7μg/mL，PI染色顯示透化效率為55%。然后將非洲...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 細胞核移植研究進展
    1.2 核移植技術(shù)的應(yīng)用前景
    1.3 體細胞核移植的重編程
        1.3.1 DNA 甲基化
        1.3.2 組蛋白乙�；�
    1.4 抽提物誘導(dǎo)體細胞重編程
        1.4.1 誘導(dǎo)體細胞重編程的經(jīng)典方法
        1.4.2 細胞抽提物誘導(dǎo)
        1.4.3 抽提物誘導(dǎo)重編程的進展
        1.4.4 抽提物誘導(dǎo)在動物克隆上的應(yīng)用
    1.5 本研究的目的與意義
第二章 爪蟾卵母細胞抽提物的提取
    前言
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 試驗儀器
        2.1.3 主要試劑、溶液配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 非洲爪蟾超數(shù)排卵
        2.2.2 爪蟾卵母細胞內(nèi)容物提取
        2.2.3 蛋白濃度的檢測
        2.2.4 SDS-PAGE 電泳
    2.3 試驗結(jié)果
        2.3.1 爪蟾超數(shù)排卵
        2.3.2 爪蟾卵母細胞內(nèi)容物提取
        2.3.3 抽提物蛋白含量測定
        2.3.4 抽提物聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 爪蟾卵母細胞抽提物誘導(dǎo)和牛胎兒成纖維細胞重編程
    前言
    3.1 試驗材料
        3.1.1 細胞
        3.1.2 試驗儀器
        3.1.3 主要試劑、溶液配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 胎兒成纖維細胞培養(yǎng)
        3.2.2 生長曲線繪制和核型分析
        3.2.3 細胞透化濃度篩選
        3.2.4 抽提物處理和牛胎兒成纖維細胞
        3.2.5 H3K9 相對免疫熒光染色
        3.2.6 堿性磷酸酶染色
        3.2.7 Oct4 免疫熒光染色
        3.2.8 western blot 分析
        3.2.9 PCR 和 qPCR 檢測
    3.3 試驗結(jié)果
        3.3.1 和牛胎兒成纖維細胞系的建立和培養(yǎng)
        3.3.2 胎兒成纖維細胞的生物學(xué)觀察
        3.3.3 透化劑濃度的篩選
        3.3.4 抽提物處理牛胎兒成纖維細胞
        3.3.5 H3K9 免疫熒光染色
        3.3.6 堿性磷酸酶染色
        3.3.7 Oct4 蛋白的表達分析
        3.3.8 抽提物處理細胞中多能性相關(guān)基因的表達檢測
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 重編程和牛胎兒成纖維細胞克隆胚胎的制備
    前言
    4.1 試驗材料
        4.1.1 試驗儀器
        4.1.2 主要試劑、溶液
    4.2 試驗方法
        4.2.1 顯微操作針的制備
        4.2.2 牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)
        4.2.3 供體細胞準(zhǔn)備
        4.2.4 卵母細胞去核
        4.2.5 無透明帶融合法構(gòu)建重構(gòu)胚
        4.2.6 重構(gòu)胚激活與培養(yǎng)
    4.3 試驗結(jié)果
        4.3.1 卵母細胞去核
        4.3.2 供體細胞準(zhǔn)備
        4.3.3 無透明帶卵母細胞的融合
        4.3.4 不同激活方式對克隆效率影響
        4.3.5 不同供體細胞對克隆效率的影響
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：4014498