斷奶仔豬腹瀉和水腫病是規(guī)模豬場(chǎng)危害最為嚴(yán)重的疾病之一,產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是造成斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌,產(chǎn)Vero細(xì)胞毒素大腸桿菌(Verotoxigenic Escherichia coli, VTEC)則與仔豬水腫病密切相關(guān)。國(guó)外學(xué)者前期研究表明,α-(1,2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1(FUT1)與E.coliF18受體基因相連鎖,可以作為控制E.coliF18粘附的候選基因。FUT1基因M307處存在G/A突變位點(diǎn),并且G對(duì)A為顯性,即AA基因型豬對(duì)E.coliF18表現(xiàn)為抗性,GG型和AG型表現(xiàn)為敏感性,并據(jù)此在國(guó)外豬種中實(shí)現(xiàn)了抗病育種。然而,在國(guó)內(nèi)地方豬種中均未檢測(cè)到FUT1基因M307AA和AG基因型個(gè)體,全部為GG基因型,呈極端偏態(tài)分布,由此可見(jiàn),中外豬種在抗E.coliF18感染過(guò)程中具有不同的遺傳機(jī)理。 課題組在前期研究中利用在蘇太豬群體中檢測(cè)到的少量FUT1基因AG型個(gè)體進(jìn)行適當(dāng)選種選配,通過(guò)多年選育,已在蘇太豬中建立了大腸桿菌病抗性(AA型)和敏感性(AG和GG型)資源家系群體。此外,課題...

【文章頁(yè)數(shù)】：150 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 斷奶仔豬腹瀉與水腫病研究簡(jiǎn)介
        1.1 斷奶仔豬腹瀉與水腫病流行病學(xué)
        1.2 造成斷奶仔豬腹瀉與水腫病的原因
        1.3 大腸桿菌F18菌株致病機(jī)理
        1.4 大腸桿菌F18菌株黏附受體研究進(jìn)展
        1.5 中外豬種F18大腸桿菌抗性遺傳基礎(chǔ)的差異
        1.6 蘇太豬及蘇太豬極端表型資源家系群體簡(jiǎn)介
    2 基因芯片
        2.1 基因芯片的產(chǎn)生
        2.2 基因芯片基本技術(shù)原理
            2.2.1 基因芯片目標(biāo)樣本的制備
            2.2.2 靶基因的雜交及其信號(hào)的檢測(cè)
        2.3 Agilent豬4x44K全基因組芯片簡(jiǎn)介
        2.4 芯片數(shù)據(jù)的處理和生物信息學(xué)分析
    3 差異蛋白質(zhì)組學(xué)
        3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)及差異蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)介
        3.2 二維凝膠電泳
        3.3 肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)及數(shù)據(jù)分析
        3.4 串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)及數(shù)據(jù)分析
        3.5 差異蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用
    4 本研究的目的和意義
第二章 斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性和敏感性個(gè)體十二指腸差異基因的篩選與驗(yàn)證
    第一節(jié) 蘇太豬F18大腸桿菌抗性和敏感性全同胞個(gè)體的確定和驗(yàn)證
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
                1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
                1.1.4 主要試劑的配制
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 豬耳組織DNA提取
                1.2.2 引物設(shè)計(jì)
                1.2.3 PCR-RFLP分析
                1.2.4 V型分泌系統(tǒng)展呈功能性黏附素和受體結(jié)合試驗(yàn)
        2 結(jié)果與分析
            2.1 FUT1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果
            2.2 FUT1基因RFLP酶切結(jié)果
            2.3 所獲取樣本E.coli F18感染狀態(tài)的檢測(cè)結(jié)果
            2.4 蘇太豬資源群體8個(gè)全同胞家系中實(shí)驗(yàn)個(gè)體的選擇
    第二節(jié) 蘇太豬F18大腸桿菌抗性和敏感性對(duì)比組基因芯片檢測(cè)
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
                1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 組織RNA的提取
                1.2.2 總RNA的純化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
                1.2.3 cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成
                1.2.4 aaUTP標(biāo)記cRNA合成
                1.2.5 cRNA純化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
                1.2.6 cRNA濃度測(cè)定
                1.2.7 cRNA樣品熒光標(biāo)記
                1.2.8 熒光標(biāo)記cRNA樣品純化(QIAGEN RNeasy(?) Mini Kit)
                1.2.9 熒光分子濃度及摻入率計(jì)算
                1.2.10 cRNA樣品片段化和芯片雜交(4x44K microarrays)
                1.2.11 芯片掃描
        2 相關(guān)軟件及統(tǒng)計(jì)方法
            2.1 相關(guān)軟件
            2.2 統(tǒng)計(jì)方法
                2.2.1 兩組間差異基因的篩選——TwoclassDif
                2.2.2 基因功能的顯著性分析——GO-Analysis
                2.2.3 Pathway的顯著性分Pathway-Analysis
        3 結(jié)果與分析
            3.1 芯片雜交質(zhì)控分析結(jié)果
            3.2 芯片分析結(jié)果
                3.2.1 大腸桿菌F18菌株敏感性(GG)和抗性(AA)組基因芯片結(jié)果分析
                    3.2.1.1 GG-AA組差異基因篩選
                    3.2.1.2 GG-AA組差異基因Gene Ontology功能注釋
                    3.2.1.3 GG-AA組差異基因Pathway分析
                3.2.2 大腸桿菌F18菌株敏感性(AG)和抗性(AA)組基因芯片結(jié)果分析
                    3.2.2.1 AG-AA組差異基因篩選
                    3.2.2.2 AG-AA組差異基因Gene Ontology功能注釋
                    3.2.2.3 AG-AA組差異基因Pathway分析
            3.3 GG-AA組和AG-AA組基因芯片綜合分析結(jié)果
                3.3.1 GG-AA組和AG-AA組差異基因綜合分析
                3.3.2 GG-AA組和AG-AA組差異基因GO功能注釋及Pathway綜合分析
    第三節(jié) 熒光定量對(duì)基因芯片結(jié)果的驗(yàn)證
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
                1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 豬十二指腸組織RNA的提取
                    1.2.1.1 提取RNA的準(zhǔn)備工作
                    1.2.1.2 Trizol法提取組織總RNA
                1.2.2 RNA的檢測(cè)
                    1.2.2.1 NANODROP 1000濃度測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和純度
                    1.2.2.2 2.2mol/L甲醛的瓊脂糖凝膠的制備
                    1.2.2.3 RNA甲醛變性電泳檢測(cè)
                1.2.3 熒光定量引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
                1.2.4 mRNA反轉(zhuǎn)錄
                1.2.5 目的基因和內(nèi)參基因片段的PCR擴(kuò)增
                1.2.6 實(shí)驗(yàn)方法組織RNA的提取
                1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            1.3 統(tǒng)計(jì)軟件和方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 RNA的提取結(jié)果
            2.2 目的基因和內(nèi)參基因的溶解曲線
            2.3 熒光定量對(duì)基因芯片驗(yàn)證結(jié)果
        3 討論
第三章 SLA-1和SLA-3基因以及鞘糖脂生物合成—球系列通路基因在F18大腸桿菌抗性和敏感性個(gè)體間的表達(dá)分析
    第一節(jié) SLA-1和SLA-3基因在F18大腸桿菌抗性和敏感性個(gè)體內(nèi)表達(dá)分析
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
                1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 豬各組織RNA的提取
                1.2.2 多重PCR檢測(cè)斷奶仔豬糞便中大腸桿菌毒素基因
                1.2.3 熒光定量引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
                1.2.4 熒光定量實(shí)驗(yàn)
            1.3 統(tǒng)計(jì)軟件和方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 RNA的提取結(jié)果
            2.2 毒素基因檢測(cè)結(jié)果
            2.3 所取樣本E.coli F18抗性與敏感性狀態(tài)的檢測(cè)結(jié)果
            2.4 SLA-1和SLA-3基因擴(kuò)增曲線與溶解曲線
            2.5 SLA-1和SLA-3基因的組織表達(dá)譜
            2.6 SLA-1和SLA-3基因在E.coli F18抗性組和敏感組之間表達(dá)比較
            2.7 SLA-1和SLA-3基因在E.coli F18抗性組和敏感組內(nèi)的線性關(guān)系分析
            2.8 SLA-1和SLA-3基因的GO和Pathway分析
        3 討論
    第二節(jié) 鞘糖脂生物合成—球系列通路關(guān)鍵基因?qū)ωiF18大腸桿菌抗性調(diào)控機(jī)理分析
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
                1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 豬各組織RNA的提取
                1.2.2 通路中關(guān)鍵基因熒光定量引物設(shè)計(jì)
                1.2.3 熒光定量實(shí)驗(yàn)
            1.3 統(tǒng)計(jì)軟件和方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7個(gè)基因組織表達(dá)譜
            2.2 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7個(gè)基因在蘇太豬E.coli F18抗性和敏感性個(gè)體十二指腸和空腸組織表達(dá)比較
            2.3 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7個(gè)基因在蘇太豬E.coli F18抗性個(gè)體十二指腸和空腸中相關(guān)性分析
            2.4 鞘糖脂生物合成-球系列通路中7個(gè)基因在蘇太豬E.coli F18敏感性個(gè)體十二指腸和空腸中相關(guān)性分析
        3 討論
第四章 F18大腸桿菌抗性和敏感型斷奶仔豬十二指腸差異蛋白的篩選鑒定及生物信息學(xué)分析
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            1.1.4 主要試劑的配制
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 豬十二指腸蛋白質(zhì)的提取
            1.2.2 蛋白質(zhì)的定量
            1.2.3 雙向電泳
                1.2.3.1 加樣品水化
                1.2.3.2 第一向等電聚焦(IEF)
                1.2.3.3 IPG膠條的平衡
                1.2.3.4 第二向SDS-PAGE電泳
            1.2.4 染色
            1.2.5 雙向電泳圖譜掃描與分析
            1.2.6 差異表達(dá)蛋白的酶解及質(zhì)譜分析
            1.2.7 差異蛋白的生物信息學(xué)分析
            1.2.8 蛋白間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)——Signal-Net
    2 結(jié)果與分析
        2.1 E.coli F18抗性和敏感性個(gè)體十二指腸蛋白質(zhì)電泳圖譜分析
        2.2 E.coli F18抗性和敏感性?xún)山M間個(gè)體十二指腸蛋白質(zhì)的表達(dá)變化
        2.3 F18大腸桿菌抗性和敏感性個(gè)體間十二指腸差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜分析
        2.4 差異蛋白生物信息學(xué)分析
            2.4.1 Gene Ontology和Pathway分析
            2.4.2 差異蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(Signal-Net)分析
    3 討論
全文結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文
參與申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利



本文編號(hào)：4011289