豬巨細(xì)胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)是一種有囊膜的雙股線性DNA病毒,可以導(dǎo)致胚胎死亡、仔豬鼻炎、矮小、肺炎和增重緩慢等癥狀,成年豬一般呈隱性感染,不表現(xiàn)臨床癥狀。PCMV主要蛋白有糖蛋白B、衣殼蛋白和DNA聚合酶蛋白。gB蛋白是PCMV的必需糖蛋白和重要免疫原,在病毒侵染宿主細(xì)胞的黏附、融合和進(jìn)入細(xì)胞以及在細(xì)胞問的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)gB蛋白作為主要的保護(hù)性抗原,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。本研究通過基因重組技術(shù)獲得重組gB蛋白,將純化的gB蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法,用于PCMV抗體的檢測和血清學(xué)調(diào)查。同時(shí),將gB蛋白免疫小鼠,利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備gB蛋白的單克隆抗體,為PCMV診斷和致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下： 1.豬巨細(xì)胞病毒gB基因原核表達(dá)與鑒定 采用PCR方法從PCMV陽性組織病料中擴(kuò)增gB基因,將其克隆至pET-32a載體。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,涂板挑選陽性單個(gè)克隆菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,原核表達(dá)產(chǎn)物大小約為40KDa。表達(dá)產(chǎn)物...

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    1 生物學(xué)特性與病毒蛋白
        1.1 病毒生物學(xué)特性
        1.2 病毒主要蛋白
    2 流行病學(xué)
    3 臨床特征和病理變化
    4 診斷技術(shù)
        4.1 電鏡觀察
        4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
        4.3 間接免疫熒光試驗(yàn)
        4.4 免疫組織化學(xué)技術(shù)
        4.5 分子診斷
            4.5.1 PCR
            4.5.2 原位雜交技術(shù)
    5 預(yù)防與控制
    參考文獻(xiàn)
第二篇 研究內(nèi)容
    第一章 豬巨細(xì)胞病毒gB基因原核表達(dá)與鑒定
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 PCMV gB基因的PCR擴(kuò)增
                1.2.2 PCR產(chǎn)物回收純化
                1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
                1.2.4 重組gB蛋白的表達(dá)
                1.2.5 表達(dá)gB蛋白的Western-blotting鑒定
        2 結(jié)果
            2.1 gB基因擴(kuò)增
            2.2 重組質(zhì)粒pET32a-gB雙酶切鑒定
            2.3 gB基因序列測定
            2.4 重組gB蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果
            2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting鑒定結(jié)果
        3 討論
        參考文獻(xiàn)
        ABSTRACT
    第二章 豬巨細(xì)胞病毒間接ELISA檢測方法的建立與初步應(yīng)用
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 重組gB蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
                1.2.2 重組gB蛋白的可溶性鑒定
                1.2.3 重組gB蛋白的純化
                1.2.4 間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化
                1.2.5 間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立
                1.2.6 特異性試驗(yàn)
                1.2.7 敏感性試驗(yàn)
                1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)
                1.2.9 臨床血清樣品檢測
        2 結(jié)果
            2.1 ELISA抗原制備
                2.1.1 重組gB蛋白表達(dá)條件優(yōu)化
                2.1.2 重組gB蛋白可溶性檢測
                2.1.3 重組gB蛋白的純化
            2.2 間接ELISA方法反應(yīng)條件優(yōu)化
            2.3 間接ELISA方法陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立
            2.4 特異性試驗(yàn)
            2.5 敏感性試驗(yàn)
            2.6 重復(fù)性試驗(yàn)
            2.7 臨床血清樣品的檢測
        3 討論
        參考文獻(xiàn)
        ABSTRACT
    第三章 抗豬巨細(xì)胞病毒gB蛋白單克隆抗體研制
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 主要材料與試劑
            1.2 抗原蛋白和檢測蛋白的制備
            1.3 動(dòng)物免疫
            1.4 間接ELISA方法檢測免疫后鼠血清效價(jià)
            1.5 單抗的制備
                1.5.1 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備
                1.5.2 飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備
                1.5.3 脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備
                1.5.4 細(xì)胞融合
                1.5.5 雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)
                1.5.6 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選
                1.5.7 陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆
                1.5.8 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
                1.5.9 腹水的制備
            1.6 單克隆抗體的鑒定
                1.6.1 單克隆抗體效價(jià)的測定
                1.6.2 單克隆抗體Ig類的鑒定
                1.6.3 單克隆抗體的特異性鑒定
                1.6.4 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性的鑒定
        2 結(jié)果
            2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立和抗體效價(jià)的測定
            2.2 單克隆抗體的Ig類鑒定
            2.3 單克隆抗體的特異性鑒定
                2.3.1 單克隆抗體與原核表達(dá)的蛋白的反應(yīng)
                2.3.2 單克隆抗體與真核表達(dá)的蛋白的反應(yīng)
            2.4 分泌抗體穩(wěn)定性的鑒定
        3 討論
        參考文獻(xiàn)
        ABSTRACT
全文總結(jié)
附錄
致謝



本文編號：3996324