IgY是鴨體內(nèi)中主要的免疫球蛋白分子之一,其在鴨體內(nèi)有兩種形態(tài)的分子,即完整型IgY分子和缺失型IgY分子。本課題研究目的在于制備抗鴨IgY Fc片段CH3-CH4單克隆抗體,這樣就能夠檢測出鴨血清中完整型IgY分子。此外抗鴨IgY Fc片段CH2的單克隆抗體可以既可以檢測到缺失型IgY分子也可以檢測完整型IgY分子。 1：鴨IgY Fc片段CH2-CH3-CH4基因的克隆與序列分析 以BSA免疫櫻桃谷肉鴨的脾臟提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增含有CH1部分序列的IgY Fc片段CH1-CH2-CH3-CH4,大小為1154bp,將目的基因與T載體連接,pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4重組質(zhì)粒測序分析結(jié)果表明在CH2-CH3-CH4基因中存在4個堿基的突變,核苷酸同源性為99%,其突變均為無義突變,氨基酸同源性為100%。以此為模板擴(kuò)增CH2-CH3-CH4基因,大小為954bp. 2：鴨IgY Fc片段CH2, CH3-CH4及CH1-CH2-CH3-CH4基因的原核表達(dá) 以pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4為模板成功擴(kuò)增CH2, CH3-CH4, CH1-...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 鴨IgY分子的研究進(jìn)展
        1.1.1 編碼IgY的基因
        1.1.2 IgY分子與哺乳動物IgG分子結(jié)構(gòu)的區(qū)別
        1.1.3 IgY分子在各類動物中的分布
        1.1.4 IgY分子的功能
        1.1.5 IgY分子的應(yīng)用
    1.2 單克隆抗體的研究進(jìn)展
        1.2.1 單克隆抗體的概念和基本原理
        1.2.2 單克隆抗體篩選的基本原理
        1.2.3 制備單克隆抗體的方法
        1.2.4 單克隆抗體的應(yīng)用
2 研究目的及意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 載體及菌株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 實驗動物
        3.1.4 試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 鴨IgY Fc片段CH2-CH3-CH4的克隆
        3.2.2 鴨IgY Fc片段(CH2,CH3-CH4)基因亞克隆
        3.2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.4 SDS-PAGE電泳
        3.2.5 表達(dá)產(chǎn)物可溶性檢測
        3.2.6 融合蛋白的純化
        3.2.7 融合蛋白的Western blot鑒定
        3.2.8 小鼠免疫以及血清效價的檢測
        3.2.9 SP2/0骨髓瘤的準(zhǔn)備
        3.2.10 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
        3.2.11 免疫脾細(xì)胞的制備
        3.2.12 細(xì)胞融合
        3.2.13 雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)與克隆
        3.2.14 小鼠腹水法生產(chǎn)單克隆抗體
        3.2.15 腹水單抗的純化
        3.2.16 單克隆抗體的鑒定
4 實驗結(jié)果
    4.1 IgY Fc片段CH2-CH3-CH4基因的克隆及其蛋白的表達(dá)
        4.1.1 IgYFc片段CH1-CH2-CH3-CH4基因的RT-PCR擴(kuò)增
        4.1.2 IgYFc片段CH2-CH3-CH4基因序列分析
        4.1.3 IgYFc片段CH2-CH3-CH4基因的亞克隆
        4.1.4 pGEX-KG-CH2-CH3-CH4重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.5 GST-CH2-CH3-CH4蛋白的SDS-PAGE以及Western blot鑒定
    4.2 IgYFc片段基因(CH2,CH3-CH4)的亞克隆及其蛋白的表達(dá)
        4.2.1 IgYFc片段CH2基因以及CH3-CH4基因的擴(kuò)增結(jié)果
        4.2.2 pET-28a-CH2以及pET-28a-CH3-CH4重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.3 His-CH2和His-CH3-CH4蛋白的SDS-PAGE以及Western blot
    4.3 鼠抗GST-CH2-CH3-CH4蛋白單克隆抗體的制備
        4.3.1 免疫小鼠血清效價的測定
        4.3.2 雜交瘤細(xì)胞株的篩選
        4.3.3 單克隆抗體的純化以及鑒定
5 討論
    5.1 融合蛋白的純化
    5.2 細(xì)胞融合
    5.3 抗IgYFc片段CH2單克隆抗體篩選失敗的原因分析
    5.4 雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆
    5.5 4F8單克隆抗體的交叉反應(yīng)試驗
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3978505