旨在研究山羊β防御素124(goat beta-defensin 124,gBD124)沉默對(duì)p38MAPK/AP1通路及下游細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)的影響。本研究將設(shè)計(jì)的3條gBD124-shRNAs載入LV10-U6/RFP&Puro質(zhì)粒載體,與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,用梯度稀釋法測(cè)定病毒原液的滴度;將構(gòu)建的3個(gè)LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC載體轉(zhuǎn)染到山羊附睪頭細(xì)胞中,篩選有效沉默載體;然后用有效沉默載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染附睪頭細(xì)胞,設(shè)置了空白細(xì)胞對(duì)照組、LV10-NC組、有效沉默載體組,用2μg·mL^-1嘌呤霉素篩選后分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA檢測(cè)gBD124、MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白、細(xì)胞因子及趨化因子基因及蛋白表達(dá)情況。本研究構(gòu)建了gBD124沉默慢病毒載體,篩選出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161兩個(gè)有效載體,并成功構(gòu)建了gBD124沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的附睪頭細(xì)胞株。與NC對(duì)照組相比,gBD124沉默顯著降低了山羊附睪頭細(xì)胞MAPK通路中MAPK1以及...

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【部分圖文】：

圖1LV10-gBD124沉默載體的shRNA序列測(cè)序結(jié)果

轉(zhuǎn)染96h后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖2�？瞻准�(xì)胞對(duì)照組(圖2A)和基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑Polybrene組(圖2B)無(wú)熒光;圖2C和2D轉(zhuǎn)染效果相比,轉(zhuǎn)染液中添加基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑5μg·mL-1Polybrene可提高慢病毒載體轉(zhuǎn)染效果;從圖2E～G轉(zhuǎn)染效果看,L....

圖6gBD124沉默對(duì)附睪頭細(xì)胞p38、c-JUN和c-FOS蛋白表達(dá)的影響

圖5gBD124沉默對(duì)附睪頭細(xì)胞MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響2.3gBD124沉默對(duì)附睪頭細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞因子基因和蛋白表達(dá)的影響

圖7gBD124沉默對(duì)附睪頭細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

哺乳動(dòng)物附睪管壁的血-附睪屏障阻止血液中免疫球蛋白、免疫細(xì)胞、病原微生物以及精子抗原等進(jìn)入附睪管腔內(nèi)[1-5,25]。β防御素是一類小分子陽(yáng)離子肽,通過(guò)免疫信號(hào)調(diào)節(jié)、免疫趨化等作用[26]發(fā)揮其抗菌活性[22,27]。有研究顯示,人[12]、鼠[28]、綿羊[29]和山羊[11....

圖2LV10-gBD124慢病毒轉(zhuǎn)染附睪頭細(xì)胞96h后熒光表達(dá)情況（100×）

圖1LV10-gBD124沉默載體的shRNA序列測(cè)序結(jié)果圖3LV10慢病毒轉(zhuǎn)染后96h附睪頭細(xì)胞gBD124相對(duì)表達(dá)量

本文編號(hào)：3971394