本文以豬圓環(huán)病毒3型的衣殼蛋白(PCV3-CP)及其核定位信號(hào)(NLS)為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)PCV3-CP的NLS序列進(jìn)行分析和改構(gòu),成功實(shí)現(xiàn)了重組PCV3-CP在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性高表達(dá)。我們還利用了小鼠模型和斑馬魚(yú)模型對(duì)重組PCV3-CP及佐劑的免疫學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組PCV3-CP可以成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體,并能夠刺激B細(xì)胞的活化,還發(fā)現(xiàn)了不同的ODN佐劑對(duì)于斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的募集有著不同作用。本研究為重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)可溶性高表達(dá)提供了新的改構(gòu)思路,并初步驗(yàn)證了通過(guò)斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)疫苗及佐劑的可行性。

【文章頁(yè)數(shù)】：94 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
中文摘要
Abstract
中英文縮寫(xiě)詞表
第一篇 緒論
    1.核定位信號(hào)的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1 核定位信號(hào)的序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.2 核定位信號(hào)的作用機(jī)制及應(yīng)用
    2.病毒衣殼蛋白疫苗的研究現(xiàn)狀
    3.豬圓環(huán)病毒的研究現(xiàn)狀
        3.1 PCV1 研究現(xiàn)狀
        3.2 PCV2 研究現(xiàn)狀
        3.3 PCV3 研究現(xiàn)狀
    4.小鼠和斑馬魚(yú)作為免疫學(xué)評(píng)價(jià)模型的應(yīng)用
    5.中性粒細(xì)胞提呈抗原的研究進(jìn)展
第二篇 研究?jī)?nèi)容
    第一章 核定位信號(hào)對(duì)病毒衣殼蛋白在E.coli中表達(dá)的影響
        1.前言
        2.材料與方法
            2.1 實(shí)驗(yàn)材料
                2.1.1 試劑與材料
                2.1.2 菌種與質(zhì)粒
                2.1.3 培養(yǎng)基配制
                2.1.4 主要儀器設(shè)備
            2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
            2.3 實(shí)驗(yàn)方法
                2.3.1 PCR獲取目的基因
                2.3.2 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化
                2.3.3 TA連接及表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.3.4 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定與可溶性鑒定
                2.3.5 工程菌發(fā)酵與蛋白質(zhì)純化
                2.3.6 Western Blotting
                2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 PCV3 衣殼蛋白的序列比對(duì)、表位預(yù)測(cè)及改構(gòu)設(shè)計(jì)
                3.1.1 PCV3 衣殼蛋白的序列比對(duì)與表位預(yù)測(cè)
                3.1.2 優(yōu)勢(shì)表位增強(qiáng)的重組蛋白的氨基酸序列設(shè)計(jì)
            3.2 重組PCV3 衣殼蛋白的構(gòu)建與表達(dá)
                3.2.1 重組PCV3 衣殼蛋白基因的獲取與TA克隆
                3.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
                3.2.3 Z蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.3 密碼子優(yōu)化的重組PCV3 衣殼蛋白的構(gòu)建與表達(dá)
                3.3.1 密碼子優(yōu)化序列的設(shè)計(jì)
                3.3.2 密碼子優(yōu)化的Z蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定
            3.4 修改核定位信號(hào)序列后的重組PCV3 衣殼蛋白的構(gòu)建與表達(dá)
                3.4.1 核定位信號(hào)序列的分析
                3.4.2 核定位信號(hào)序列的修改
                3.4.3 修改核定位信號(hào)的重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定
                3.4.4 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
                3.4.5 工程菌發(fā)酵與蛋白質(zhì)純化
                3.4.6 重組PCV3-CP在 SDS-PAGE中條帶異常現(xiàn)象的探究
        4.討論
            4.1 重組PCV3 衣殼蛋白的設(shè)計(jì)
            4.2 核定位信號(hào)序列對(duì)蛋白表達(dá)的影響
            4.3 提高蛋白表達(dá)量和可溶性的策略
            4.4 SDS-PAGE條帶異�，F(xiàn)象的探究
        5.本章小結(jié)
    第二章 重組PCV3 疫苗免疫學(xué)活性的研究
        1.前言
        2.材料與方法
            2.1 實(shí)驗(yàn)材料
                2.1.1 試劑與材料
                2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                2.1.3 主要儀器設(shè)備
            2.2 實(shí)驗(yàn)方法
                2.2.1 疫苗的配制
                2.2.2 小鼠的免疫與采血
                2.2.3 ELISA檢測(cè)血清特異性抗體水平
                2.2.4 脾細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
                2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)
                2.2.6 斑馬魚(yú)的注射
                2.2.7 斑馬魚(yú)的熒光觀(guān)測(cè)
                2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 應(yīng)用小鼠模型評(píng)價(jià)Zr蛋白的免疫學(xué)活性
                3.1.1 Zr蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體的研究
                3.1.2 Zr蛋白對(duì)小鼠B細(xì)胞活化作用的研究
            3.2 斑馬魚(yú)作為免疫應(yīng)答模型的初探
                3.2.1 單獨(dú)注射ODN或 PBS后斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的募集情況
                3.2.2 注射Zr+CpG684 后斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的募集情況
        4.討論
            4.1 重組PCV3 疫苗在小鼠模型中的免疫學(xué)活性
            4.2 斑馬魚(yú)作為疫苗評(píng)價(jià)模型的初步應(yīng)用
        5.本章小結(jié)
    第三章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3964450