本文以豬圓環(huán)病毒3型的衣殼蛋白(PCV3-CP)及其核定位信號(NLS)為研究對象,通過對PCV3-CP的NLS序列進行分析和改構(gòu),成功實現(xiàn)了重組PCV3-CP在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的可溶性高表達。我們還利用了小鼠模型和斑馬魚模型對重組PCV3-CP及佐劑的免疫學活性進行評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組PCV3-CP可以成功誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗體,并能夠刺激B細胞的活化,還發(fā)現(xiàn)了不同的ODN佐劑對于斑馬魚中性粒細胞的募集有著不同作用。本研究為重組蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)可溶性高表達提供了新的改構(gòu)思路,并初步驗證了通過斑馬魚模型評價疫苗及佐劑的可行性。

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
中文摘要
Abstract
中英文縮寫詞表
第一篇 緒論
    1.核定位信號的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1 核定位信號的序列及結(jié)構(gòu)特點
        1.2 核定位信號的作用機制及應(yīng)用
    2.病毒衣殼蛋白疫苗的研究現(xiàn)狀
    3.豬圓環(huán)病毒的研究現(xiàn)狀
        3.1 PCV1 研究現(xiàn)狀
        3.2 PCV2 研究現(xiàn)狀
        3.3 PCV3 研究現(xiàn)狀
    4.小鼠和斑馬魚作為免疫學評價模型的應(yīng)用
    5.中性粒細胞提呈抗原的研究進展
第二篇 研究內(nèi)容
    第一章 核定位信號對病毒衣殼蛋白在E.coli中表達的影響
        1.前言
        2.材料與方法
            2.1 實驗材料
                2.1.1 試劑與材料
                2.1.2 菌種與質(zhì)粒
                2.1.3 培養(yǎng)基配制
                2.1.4 主要儀器設(shè)備
            2.2 引物設(shè)計與合成
            2.3 實驗方法
                2.3.1 PCR獲取目的基因
                2.3.2 感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化
                2.3.3 TA連接及表達載體的構(gòu)建
                2.3.4 蛋白的誘導表達鑒定與可溶性鑒定
                2.3.5 工程菌發(fā)酵與蛋白質(zhì)純化
                2.3.6 Western Blotting
                2.3.7 統(tǒng)計學分析
        3.實驗結(jié)果
            3.1 PCV3 衣殼蛋白的序列比對、表位預測及改構(gòu)設(shè)計
                3.1.1 PCV3 衣殼蛋白的序列比對與表位預測
                3.1.2 優(yōu)勢表位增強的重組蛋白的氨基酸序列設(shè)計
            3.2 重組PCV3 衣殼蛋白的構(gòu)建與表達
                3.2.1 重組PCV3 衣殼蛋白基因的獲取與TA克隆
                3.2.2 重組表達載體的構(gòu)建
                3.2.3 Z蛋白的誘導表達
            3.3 密碼子優(yōu)化的重組PCV3 衣殼蛋白的構(gòu)建與表達
                3.3.1 密碼子優(yōu)化序列的設(shè)計
                3.3.2 密碼子優(yōu)化的Z蛋白的誘導表達鑒定
            3.4 修改核定位信號序列后的重組PCV3 衣殼蛋白的構(gòu)建與表達
                3.4.1 核定位信號序列的分析
                3.4.2 核定位信號序列的修改
                3.4.3 修改核定位信號的重組蛋白的誘導表達鑒定
                3.4.4 誘導條件的優(yōu)化
                3.4.5 工程菌發(fā)酵與蛋白質(zhì)純化
                3.4.6 重組PCV3-CP在 SDS-PAGE中條帶異�，F(xiàn)象的探究
        4.討論
            4.1 重組PCV3 衣殼蛋白的設(shè)計
            4.2 核定位信號序列對蛋白表達的影響
            4.3 提高蛋白表達量和可溶性的策略
            4.4 SDS-PAGE條帶異常現(xiàn)象的探究
        5.本章小結(jié)
    第二章 重組PCV3 疫苗免疫學活性的研究
        1.前言
        2.材料與方法
            2.1 實驗材料
                2.1.1 試劑與材料
                2.1.2 實驗動物
                2.1.3 主要儀器設(shè)備
            2.2 實驗方法
                2.2.1 疫苗的配制
                2.2.2 小鼠的免疫與采血
                2.2.3 ELISA檢測血清特異性抗體水平
                2.2.4 脾細胞的分離與培養(yǎng)
                2.2.5 流式細胞術(shù)
                2.2.6 斑馬魚的注射
                2.2.7 斑馬魚的熒光觀測
                2.2.8 統(tǒng)計學分析
        3.實驗結(jié)果
            3.1 應(yīng)用小鼠模型評價Zr蛋白的免疫學活性
                3.1.1 Zr蛋白誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗體的研究
                3.1.2 Zr蛋白對小鼠B細胞活化作用的研究
            3.2 斑馬魚作為免疫應(yīng)答模型的初探
                3.2.1 單獨注射ODN或 PBS后斑馬魚中性粒細胞的募集情況
                3.2.2 注射Zr+CpG684 后斑馬魚中性粒細胞的募集情況
        4.討論
            4.1 重組PCV3 疫苗在小鼠模型中的免疫學活性
            4.2 斑馬魚作為疫苗評價模型的初步應(yīng)用
        5.本章小結(jié)
    第三章 結(jié)論
參考文獻
致謝



本文編號：3964450