目的:本實驗在巴什拜羊和盤羊雜交羊SP-A基因表達和純化的基礎上,研究重組SP-A蛋白(rSP-A)對體外培養(yǎng)的綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)增殖、代謝的影響,對MO黏附作用的影響,以及對嗜酸性粒細胞(EOS)殺傷MO作用的影響。為研究rSP-A的體外生物學功能奠定基礎。方法:(1)SP-A基因的表達及蛋白純化:利用已構建好的巴什拜羊和盤羊雜交羊重組巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-SP-A陽性克隆株,甲醇誘導表達96 h,采用Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化,SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白。(2)rSP-A對MO增殖的影響:將不同濃度(10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)巴什拜羊和盤羊雜交羊的rSP-A添加于MO培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng),采用平板菌落計數(shù)法觀察MO菌落數(shù),實時熒光定量PCR法檢測MO 16S rRNA表達量。(3)rSP-A對MO代謝的影響:將不同濃度兩種羊的rSP-A添加于MO培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng),于1 d、3 d、5 d、7 d收集培養(yǎng)液,使用酸化法檢測培養(yǎng)液在550nm的吸光值(OD₅₅₀

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要略縮詞
第一章 緒論
    一、目的與意義
    二、文獻綜述
        1.SP-A的研究進展
        2.綿羊肺炎支原體概述
        3.巴什拜羊與盤羊雜交羊生物學特性
        4.黏附素P113 的概述
        5.SP-A與嗜酸性粒細胞的作用
    三、研究內容
第二章 試驗部分
    試驗Ⅰ巴什拜羊與盤羊雜交羊SP-A基因的真核表達及純化
        1.材料和方法
            1.1 材料
            1.2 實驗方法
        2.結果
        3.討論
    試驗Ⅱ巴什拜羊、盤羊雜交羊重組SP-A蛋白對體外培養(yǎng)MO增殖的影響
        1.材料和方法
            1.1 材料
            1.2 平板菌落計數(shù)測定r SP-A對 MO生長的影響
            1.3 熒光定量PCR檢測SP-A對 MO16S rRNA增殖的影響
            1.4 數(shù)據(jù)處理
        2.結果
            2.1 平板菌落計數(shù)結果
            2.2 MO16S rRNA基因擴增結果
            2.3 質粒PCR結果
            2.4 標準曲線的建立
            2.5 實時熒光定量PCR檢測曲線結果
            2.6 MO16S rRNA表達量結果
        3.討論
    試驗Ⅲ 巴什拜羊和盤羊雜交羊重組SP-A蛋白對體外培養(yǎng)的MO代謝的影響
        1.材料和方法
            1.1 實驗材料
            1.2 酸化測定SP-A對 MO代謝的作用
            1.3 數(shù)據(jù)處理
        2.結果
        3.討論
    試驗Ⅳ 巴什拜羊和盤羊雜交羊重組SP-A蛋白對體外培養(yǎng)的MO黏附的影響
        1.材料與方法
            1.1 材料
            1.2 半數(shù)顏色變化單位法測定r SP-A對 MO黏附率的影響
            1.3 熒光定量法測定r SP-A對 MO黏附素P113 的影響
            1.4 數(shù)據(jù)處理
        2.結果
            2.1 細胞培養(yǎng)結果
            2.2 顏色變化單位法對MO黏附率的影響結果
            2.3 熒光定量PCR檢測P113 相對表達量結果
        3.討論
    試驗Ⅴ巴什拜羊和盤羊雜交羊r SP-A蛋白對嗜酸性粒細胞殺傷MO的影響
        1.材料與方法
            1.1 材料
            1.2 嗜酸性粒細胞的分離
            1.3 重組SP-A蛋白對嗜酸性粒細胞殺傷MO的影響
            1.4 數(shù)據(jù)處理
        2.結果
            2.1 嗜酸性粒細胞分離結果
            2.2 重組SP-A蛋白對嗜酸性粒細胞殺傷MO的結果
        3.討論
第三章 全文總結
創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
    1.培養(yǎng)基制備
    2.SDS-PAGE電泳所需試劑配制
    3.分離嗜酸性粒細胞所需溶液的制備
致謝
作者簡介
導師評閱表



本文編號：3963263