目的:本實(shí)驗(yàn)在巴什拜羊和盤羊雜交羊SP-A基因表達(dá)和純化的基礎(chǔ)上,研究重組SP-A蛋白(rSP-A)對體外培養(yǎng)的綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)增殖、代謝的影響,對MO黏附作用的影響,以及對嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)殺傷MO作用的影響。為研究rSP-A的體外生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。方法:(1)SP-A基因的表達(dá)及蛋白純化:利用已構(gòu)建好的巴什拜羊和盤羊雜交羊重組巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-SP-A陽性克隆株,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h,采用Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化,SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白。(2)rSP-A對MO增殖的影響:將不同濃度(10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)巴什拜羊和盤羊雜交羊的rSP-A添加于MO培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng),采用平板菌落計(jì)數(shù)法觀察MO菌落數(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測MO 16S rRNA表達(dá)量。(3)rSP-A對MO代謝的影響:將不同濃度兩種羊的rSP-A添加于MO培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng),于1 d、3 d、5 d、7 d收集培養(yǎng)液,使用酸化法檢測培養(yǎng)液在550nm的吸光值(OD₅₅₀

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要略縮詞
第一章 緒論
    一、目的與意義
    二、文獻(xiàn)綜述
        1.SP-A的研究進(jìn)展
        2.綿羊肺炎支原體概述
        3.巴什拜羊與盤羊雜交羊生物學(xué)特性
        4.黏附素P113 的概述
        5.SP-A與嗜酸性粒細(xì)胞的作用
    三、研究內(nèi)容
第二章 試驗(yàn)部分
    試驗(yàn)Ⅰ巴什拜羊與盤羊雜交羊SP-A基因的真核表達(dá)及純化
        1.材料和方法
            1.1 材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.結(jié)果
        3.討論
    試驗(yàn)Ⅱ巴什拜羊、盤羊雜交羊重組SP-A蛋白對體外培養(yǎng)MO增殖的影響
        1.材料和方法
            1.1 材料
            1.2 平板菌落計(jì)數(shù)測定r SP-A對 MO生長的影響
            1.3 熒光定量PCR檢測SP-A對 MO16S rRNA增殖的影響
            1.4 數(shù)據(jù)處理
        2.結(jié)果
            2.1 平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果
            2.2 MO16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果
            2.3 質(zhì)粒PCR結(jié)果
            2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測曲線結(jié)果
            2.6 MO16S rRNA表達(dá)量結(jié)果
        3.討論
    試驗(yàn)Ⅲ 巴什拜羊和盤羊雜交羊重組SP-A蛋白對體外培養(yǎng)的MO代謝的影響
        1.材料和方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 酸化測定SP-A對 MO代謝的作用
            1.3 數(shù)據(jù)處理
        2.結(jié)果
        3.討論
    試驗(yàn)Ⅳ 巴什拜羊和盤羊雜交羊重組SP-A蛋白對體外培養(yǎng)的MO黏附的影響
        1.材料與方法
            1.1 材料
            1.2 半數(shù)顏色變化單位法測定r SP-A對 MO黏附率的影響
            1.3 熒光定量法測定r SP-A對 MO黏附素P113 的影響
            1.4 數(shù)據(jù)處理
        2.結(jié)果
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果
            2.2 顏色變化單位法對MO黏附率的影響結(jié)果
            2.3 熒光定量PCR檢測P113 相對表達(dá)量結(jié)果
        3.討論
    試驗(yàn)Ⅴ巴什拜羊和盤羊雜交羊r SP-A蛋白對嗜酸性粒細(xì)胞殺傷MO的影響
        1.材料與方法
            1.1 材料
            1.2 嗜酸性粒細(xì)胞的分離
            1.3 重組SP-A蛋白對嗜酸性粒細(xì)胞殺傷MO的影響
            1.4 數(shù)據(jù)處理
        2.結(jié)果
            2.1 嗜酸性粒細(xì)胞分離結(jié)果
            2.2 重組SP-A蛋白對嗜酸性粒細(xì)胞殺傷MO的結(jié)果
        3.討論
第三章 全文總結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
    1.培養(yǎng)基制備
    2.SDS-PAGE電泳所需試劑配制
    3.分離嗜酸性粒細(xì)胞所需溶液的制備
致謝
作者簡介
導(dǎo)師評閱表



本文編號：3963263