鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白Gα12參與多種細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié),但是在口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)方面的研究較少。本研究中,用FMDV感染PK-15細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Gα12的mRNA和蛋白水平都有所上調(diào),預(yù)示Gα12可能與FMDV復(fù)制存在某種聯(lián)系,需要進一步研究Gα12蛋白對FMDV在PK-15細(xì)胞上復(fù)制的影響。為此,在過表達Gα12和干擾Gα12表達的情況下,通過實時熒光定量、Western blot和TCID₅₀檢測Gα12對FMDV復(fù)制的影響。結(jié)果表明,過表達Gα12后,FMDV的mRNA水平、蛋白水平和病毒滴度都有所降低,然而,下調(diào)Gα12后,FMDV的復(fù)制呈相反的趨勢,說明Gα12可以抑制FMDV在PK-15細(xì)胞上的復(fù)制。本研究首次發(fā)現(xiàn)Gα12具有抑制口蹄疫病毒復(fù)制的作用,為抗FMDV的研究提供了新思路和理論基礎(chǔ),對FMDV相關(guān)研究具有重要意義。

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圖3FMDV感染上調(diào)Gα12

綜上所述,FMDV感染后上調(diào)Gα12在基因和蛋白水平的表達。2.4過表達Gα12抑制FMDV的復(fù)制

圖1Gα12真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Gα12-myc的構(gòu)建與鑒定

利用引物對Gα12基因進行擴增后,進行1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測到1023bp擴增條帶(圖1A),大小與預(yù)測相符。將經(jīng)NheⅠ和BamHⅠ雙酶切的片段與pcDNA3.1/myc-His(-)載體連接,轉(zhuǎn)化Trans5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,進行NheⅠ與BamHⅠ雙酶切....

圖2pcDNA3.1-Gα12-myc質(zhì)粒的表達

將pcDNA3.1-Gα12-myc真核表達質(zhì)粒和pcDNA3.1/myc-His(-)對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,36h收取細(xì)胞樣品,用小鼠抗myc單抗進行Westernblot檢測,檢測到40ku條帶,大小與預(yù)測相符合,表明質(zhì)粒Gα12-myc在PK-15細(xì)胞中成功....

圖4過表達Gα12抑制口蹄疫病毒復(fù)制

為了驗證Gα12過表達對FMDV復(fù)制的影響,將pcDNA3.1-Gα12-myc真核質(zhì)粒以不同劑量(0、1和2μg)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后接FMDV(MOI=0.5),24h后收取細(xì)胞樣品。如圖4A所示,隨著Gα12蛋白表達量的升高,FMDV的蛋白量逐漸下降;....

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